ГОСТ EN 14148-2015 Продукция пищевая. Определение витамина K с индексом 1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ГОСТ EN 14148-2015

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПИЩЕВАЯ

Определение витамина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Foodstuffs. Determination of vitamin by high performance liquid chromatographic method

МКС 67.050

Дата введения 2017-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС)

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по переписке (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 мая 2016 г. N 312-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14148-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14148:2003* "Продукция пищевая. Определение витамина K1 с помощью ВЭЖХ" ("Foodstuffs. Determination of vitamin K1 by HPLC", IDT)
________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт . - .

Европейский стандарт EN 14148:2003 разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

Официальный экземпляр европейского стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и европейского стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им нормативные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение витамина проводится путем измерения восстановленного филлохинона. Метод прошел валидацию для молока и детских смесей, однако известен опыт лабораторий, который показал, что метод также применим к другой пищевой продукции [10].

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходим следующий ссылочный документ*. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).
_______________

* Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. по ссылке. - .

EN ISO 3696 Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода

Витамин отделяют в растворе пробы от сопутствующих веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и определяют флуориметрическим методом после восстановления в послеколоночном реакторе. Количественно определяют сумму изомеров витамина , которые на колонках с фазой выходят в виде единого неразрешенного пика [1]-[4].

4 Реактивы

4.1 Общие положения

Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или дистиллированную воду.

4.2 Химические вещества и растворы

4.2.1 Метанол, массовая доля ()99,8%.

4.2.2 Этанол, объемная доля ()99,8%.

4.2.3 Смесь этанола и метанола, объемная доля ()=95%

Смешивают 950 см этанола (4.2.2) с 50 см метанола (4.2.1).

4.2.4 Дихлорметан, массовая доля ()99,5%.

4.2.5 Н-гексан, массовая доля ()97%.

4.2.6 Петролейный эфир, с диапазоном температуры кипения 35-60°С, ч.д.а.

4.2.7 Гидроксид калия, массовая доля (KOH)85%.

4.2.8 Раствор гидроксида калия молярной концентрации (КОН)=10 моль/дм.

4.2.9 Калий фосфорнокислый однозамещенный, массовая доля ()99,5%.

4.2.10 Карбонат калия, массовая доля ()99,9%.

4.2.11 Ацетат натрия, безводный, массовая доля ()99,5%.

4.2.12 Уксусная кислота, массовая доля ()99,8%.

4.2.13 Хлорид цинка, массовая доля ()98%.

4.2.14 Цинк, порошок, размер частиц <63 мкм, массовая доля (Zn)97%.

4.2.15 Фосфатный буфер с рН 7,9-8,0

Растворяют 54,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного (4.2.9) примерно в 350 см воды, регулируют рН до 7,9-8,0 раствором гидроксида калия (4.2.8) и разбавляют до 500 см водой.

4.2.16 Раствор хлорида-ацетата цинка

Взвешивают 13,7 г хлорида цинка (4.2.13), 4,1 г безводного натрия ацетата (4.2.11) и 3,0 г уксусной кислоты (4.2.12) и переносят в мерную колбу вместимостью 50 см, растворяют в метаноле (4.2.1) и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом.

4.2.17 Липаза типа VII

Липаза из Candida rugosa с каталитической активностью 1000 Ед/мг или другой подходящий вариант. Могут использоваться другие источники фермента из видов Pseudomonas и Rhizopus с учетом разницы в показателях активности.
_______________
Например, L-1754; Sigma Chemical Со, P.O. 14508, Saint Louis МО 63178, USA (США). Указанный продукт использовался в межлабораторном испытании. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанного продукта со стороны CEN. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если было установлено, что они дают аналогичные результаты.

4.2.18 Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Смешивают 100 смдихлорметана (4.2.4), 900 см метанола (4.2.1) и 5 см раствора хлорида-ацетата цинка (4.2.16). Фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

4.3 Витамин , образец сравнения (филлохинон, 3-фитилменадион), массовая доля ()99%

Витамин можно приобрести у различных поставщиков. Степень чистоты филлохинона может отличаться. Поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом в ультрафиолетовой области (см. 4.4.4).

4.4 Исходные растворы

4.4.1 Меры предосторожности

Витамин очень чувствителен к свету. Следует принять меры по защите образца сравнения и соответствующих растворов в процессе выполнения методики с использованием лабораторной посуды из коричневого стекла.

4.4.2 Исходный раствор I витамина , массовой концентрацией ()=1,0 мг/см

Взвешивают около 100 мг (точная навеска) образца сравнения витамина (4.3), переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в метаноле (4.2.1) и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом. Раствор можно хранить в среде азота в течение 3 мес при температуре минус 20°С в темном месте.

Примечание - При растворении указанных количеств витамина могут возникнуть затруднения.

4.4.3 Исходный раствор II витамина , массовой концентрацией ()=50,0 мкг/см

Переносят пипеткой 5,0 см исходного раствора I витамина (4.4.2) в мерную колбу вместимостью 100 см и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1). Раствор может храниться в среде азота в течение 1 мес при температуре минус 20°С в темном месте.

4.4.4 Определение массовой концентрации

Выпаривают 5,0 см исходного раствора II витамина (4.4.3) с помощью ротационного испарителя в условиях частичного вакуума или под воздействием потока азота. Повторно растворяют осадок в 25,0 см н-гексана (4.2.5) или петролейного эфира (4.2.6).

Измеряют на спектрофотометре (5.1) оптическую плотность раствора в кювете с оптической длиной пути 1 см относительно н-гексана или петролейного эфира в качестве образца сравнения в максимуме поглощения при длине волны около 248 нм. Рассчитывают массовую концентрацию витамина в исходном растворе II витамина (4.4.3) , мкг/см, по формуле

, (1)

где - величина оптической плотности раствора в максимуме поглощения при длине волны около 248 нм;

10 - коэффициент для перевода см в микрограмм на миллилитр;

5 - коэффициент разбавления при замене растворителя метанола на н-гексан;

419 - величина витамина в н-гексане (4.2.5) или петролейном эфире (4.2.6) при 248 нм ([5]);

4.5 Стандартные растворы

4.5.1 Промежуточный стандартный раствор витамина , массовая концентрация ()=2,5 мкг/см

Пипеткой переносят 5,0 см исходного раствора II витамина (4.4.3) в мерную колбу вместимостью 100 см и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1).

4.5.2 Стандартный аналитический раствор витамина для ВЭЖХ, массовая концентрация ()=25,0 нг/см

Пипеткой переносят 1 см промежуточного стандартного раствора витамина (4.5.1) в мерную колбу из коричневого стекла вместимостью 100 см и объем содержимого колбы доводят до метки метанолом (4.2.1). Данный раствор должен быть свежеприготовленным.

5 Оборудование

Используют стандартное лабораторное оборудование, в том числе перечисленное ниже.

5.1 Ультрафиолетовый спектрофотометр

УФ-спектрофотометр, способный измерять оптическую плотность при установленной длине волны, в кюветах с оптической длиной пути 1 см.

5.2 Система для ВЭЖХ

Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для инжекции проб, флуориметрического детектора, позволяющего выполнять измерения при заданных длинах волн (например, при длине волны возбуждения 243 нм и длине регистрации 430 нм), и системы для сбора и обработки данных (например, интегратора).

5.3 Колонка для ВЭЖХ

Аналитическая колонка с обращенной фазой, диаметром 3,0-4,6 мм, длиной 100-250 мм, заполненная частицами размером 3-10 мкм.

Допускается использовать колонки других размеров или с частицами другого размера. В этом случае параметры разделения должны быть адаптированы к таким материалам, чтобы обеспечить аналогичные результаты.

Могут использоваться и другие системы (см. приложение С), которые обеспечивают надлежащее разделение филлохинона от других совместно экстрагируемых компонентов пробы.

5.4 Система послеколоночной дериватизации

Колонка из нержавеющей стали или стекла, помещенная между аналитической колонкой и флуориметрическим детектором, диаметром 2,0-6,0 мм, длиной 10-150 мм, заполненная цинковым порошком (4.2.14).

5.5 Устройство для фильтрации

Подходит мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрация подвижной фазы, так же как и раствора пробы, через мембранный фильтр до использования или инжектирования может увеличить срок службы колонок.

6 Методика проведения испытания

6.1 Меры предосторожности

Витамин очень чувствителен к свету. Во время проведения испытаний следует принимать меры для защиты пробы и соответствующих растворов с использованием лабораторной посуды из коричневого стекла.

6.2 Подготовка аналитической пробы

Гомогенизируют аналитическую пробу. Измельчают грубый материал при помощи соответствующего измельчителя и снова перемешивают, предварительно охлаждая, чтобы не допустить воздействия высокой температуры в течение длительного периода.

6.3 Приготовление раствора пробы

6.3.1 Экстракция из пробы

Взвешивают 1 г порошкообразной или 10 г жидкой пробы с точностью до 0,001 г в закрывающуюся аналитическую пробирку или коническую колбу. В порошкообразную пробу добавляют 15 см воды с температурой 40°С и перемешивают на вортексе, в жидкую пробу добавляют 5 см воды с температурой 40°С. Проводят холостой опыт, используя только реактивы без пробы (см. 6.5).

6.3.2 Обработка ферментом

Добавляют 5 см фосфатного буфера с рН 7,9-8,0 (4.2.15) и перемешивают. Добавляют 1,0 г липазы (4.2.17), перемешивают на вортексе, закрывают пробкой и встряхивают в течение примерно 2-3 мин. Выдерживают смесь при температуре (37±2)°С в течение 2 ч. Через равные промежутки времени, например 20 мин, энергично встряхивают смесь вручную.

6.3.3 Экстракция

Смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 см смеси этанола и метанола (4.2.3) и 1,0 г карбоната калия (4.2.10) и хорошо перемешивают. Добавляют установленный объем (30 см) н-гексана (4.2.5) и энергично встряхивают. Затем оставляют в темном месте до разделения фаз или центрифугируют при 2000g в течение 10 мин. Н-гексановый экстракт можно хранить в течение ночи при температуре 4°С в среде азота в темном месте.

6.3.4 Перенос и разбавление фазы

Переносят в виалу пипеткой аликвотный объем фазы н-гексана (6.3.3): 0,5 см для обогащенной пробы и 5,0 см для необогащенной пробы. Удаляют растворитель в токе азота и снова растворяют осадок в установленном объеме метанола (4.2.1) - 1,0 см, получая раствор анализируемой пробы для анализа методом ВЭЖХ.

6.4 Идентификация

Идентифицируют витамин , сравнивая время удержания пика на хроматограммах, полученных при анализе раствора анализируемой пробы (6.3.4) и стандартного аналитического раствора (4.5.2). Идентификацию пика также можно выполнить, если добавлять соответствующие стандартные растворы в небольшом количестве в раствор анализируемой пробы.

Было доказано, что разделение и количественный анализ являются удовлетворительными при соблюдении указанных ниже экспериментальных условий (см. также рисунки А.1-А.3). Альтернативные условия ВЭЖХ приведены в таблице С.1.

Примечания

1 На неподвижных фазах С18 изомеры витамина (цис- и транс-) элюируются единым неразрешенным пиком ([6], [7]). Современные исследования показали, что разделение изомеров в пробах пищевой продукции может быть осуществлено на колонках с фазой С30 ([10]). В стандартных растворах и концентратах проб изомеры могут быть определены в условиях нормальнофазовой хроматографии с применением ультрафиолетового детектирования ([8], [9]).

2 В ходе экспериментальных исследований было установлено, что колонку для дериватизации можно нагреть до 40°С во время проведения анализов методом ВЭЖХ, для ускорения дериватизации.

6.5 Определение

Инжектируют 20 мм стандартного раствора анализируемой пробы (4.5.2) и аналитического раствора пробы (6.3.4) в хроматографическую систему.

При использовании метода внешнего стандарта находят интегрированием значения площадей пиков или определяют высоты пиков и сравнивают результаты с соответствующими значениями для образца сравнения.

Обычно концентрация витамина в растворе пробы очень мала. Поэтому, чтобы избежать загрязнений, все работы необходимо проводить с использованием чистой лабораторной посуды. Чтобы убедиться в отсутствии загрязнений, проводят холостую пробу с использованием тех же количеств реактивов, но без анализируемой пробы.

7 Обработка результатов измерений

Результат измерений рассчитывают при помощи градуировочной характеристики, либо используют соответствующие программы интегратора, либо применяют следующий упрощенный способ.

Рассчитывают массовую долю витамина , мкг/100 г пробы, по формуле

, (2)

где - площадь пика или высота пика витамина , полученная при использовании раствора анализируемой пробы (6.3.4), в единицах площади или высоты;

- массовая концентрация витамина в стандартном аналитическом растворе (4.5.2), нг/см;

- конечный объем аналитического раствора пробы (6.3.4), см;

- объем экстракта н-гексана (6.3.3), см;

100 - коэффициент для перевода массовой доли на 100 г пробы;

- площадь пика или высота пика витамина , полученная при использовании стандартного аналитического раствора (4.5.2), в единицах площади или высоты;

- масса пробы, г;

- объем аликвоты экстракта, использованной для переноса фазы, см;

1000 - коэффициент для перевода нанограммов в микрограммы.

Результат измерений для витамина регистрируют в протоколе в микрограммах на 100 г пробы.

8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Данные по прецизионности определения витамина были получены в 1998 году при межлабораторном испытании, проводимом в соответствии с Международным руководством АОАС на различных обогащенных и необогащенных пробах молочных продуктов [4]. Эти данные представлены в приложении В. Результаты, полученные в ходе совместного исследования, не обязательно могут быть применены к содержанию исследуемого вещества и матрицам пробы, отличным от представленных в приложении В.

8.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытаний, которые были получены при применении одного и того же метода на идентичном испытательном материале одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости более чем в 5% случаев.

Значения для витамина :

_______________
Принято опорное значение при испытаниях (94±10) мкг/100 г.


Число в скобках - номер пробы в таблице В.1 (см. приложение В).

8.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между двумя отдельными результатами испытаний, полученными при применении одного и того же метода на идентичном испытательном материале двумя лабораториями, не должно превышать предел воспроизводимости более чем в 5% случаев.

Значения для витамина :

_______________
Принято опорное значение при испытаниях (94±10) мкг/100 г.


Число в скобках - номер пробы в таблице В.1 (см. приложение В).

9 Протокол испытаний

Протокол испытания должен содержать следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или примененный метод;

c) дату и тип методики отбора пробы (если они известны);

d) дату поступления пробы в лабораторию;

e) дату проведения испытания;

f) результаты испытания с указанием единиц выражения результатов;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытания;

h) все операции, не оговоренные в методике или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результаты испытания.

Приложение А (справочное). Примеры хроматограмм

Приложение А
(справочное)

Рисунок А.1 - Пример разделения витамина К(1) из пробы 1 (ультрапастеризованное цельное жидкое необогащенное молоко) методом ВЭЖХ

А - интенсивность, мВ;

В - время, мин.

Рисунок А.1 - Пример разделения витамина из пробы 1 (ультрапастеризованное цельное жидкое необогащенное молоко) методом ВЭЖХ

Рисунок А.2 - Пример разделения витамина К(1) из пробы 2 (сухое молоко из цельного козьего молока) методом ВЭЖХ

А - интенсивность, мВ;

В - время, мин.

Рисунок А.2 - Пример разделения витамина из пробы 2 (сухое молоко из цельного козьего молока) методом ВЭЖХ

Рисунок А.3 - Пример разделения витамина К(1) из пробы 5 (обогащенные детские смеси на основе сои с повышенной жирностью) методом ВЭЖХ

А - интенсивность, мВ;

В - время, мин.

Рисунок А.3 - Пример разделения витамина из пробы 5 (обогащенные детские смеси на основе сои с повышенной жирностью) методом ВЭЖХ

Приложение В (справочное). Данные по прецизионности

Приложение В
(справочное)

Следующие данные по прецизионности были установлены при межлабораторном совместном испытании [4].


Таблица В.1

Приложение С (справочное). Альтернативные системы ВЭЖХ

Приложение С
(справочное)

Разделение и количественное определение витамина было признано удовлетворительным при применении следующих хроматографических условий [4].


Таблица С.1

Приложение ДА (справочное). Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным стандартам

Приложение ДА
(справочное)

Таблица ДА.1

Библиография

Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2016