ГОСТ 29267-91 Картофель семенной. Оздоровленный исходный материал. Приемка и методы анализа

ГОСТ 29267-91

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КАРТОФЕЛЬ СЕМЕННОЙ

ОЗДОРОВЛЕННЫЙ ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ПРИЕМКА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Издание официальное

Москва

Стандартинформ

2010

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КАРТОФЕЛЬ СЕМЕННОЙ Оздоровленный исходный материал

Приемка и методы анализа ГОСТ

29267-91

Seed potatoes. Normalized initial material.

Acceptance rules and methods of analysis

MKC 65.020.20 ОКСТУ 9731

Дата введения 01,01,93

Настоящий стандарт устанавливает правила приемки и методы определения качества оздоровленного исходного материала картофеля.

Требования настоящего стандарта являются обязательными.

1. ПРИЕМКА

1.1. Оздоровленный исходный материал картофеля принимают партиями. Партией считают любое количество оздоровленного исходного материала картофеля одного ботанического сорта, одного метода получения, предъявленное к приемке одновременно и оформленное одним документом о качестве — аттестатом (см. приложения 1—2).

При обнаружении очагов карантинных болезней и вредителей в областях, краях и республиках, не имеющих областного деления, каждую партию сопровождают карантинным сертификатом.

1.2. Для контроля качества оздоровленного исходного материала картофеля отбирают пробы растений, клубней.

1.3. Порядок отбора проб

1.3.1. От исходных растений, полученных в культуре in vitro из микрочеренков, для оценки по внешним признакам и методом иммуноферментного анализа (ИФА) отбирают пробы из разных мест партии методом случайного отбора. Размер пробы должен составлять не менее 1 % растений по счету.

1.3.2. Контроль качества микроклубней методом ИФА проводят в стадии роста растений in vitro. Пробы отбирают по и. 1.3.1.

1.3.3. Пробы в поле, теплице для ИФА отбирают равномерно по диагонали участка:

в теплице — не менее чем от 1 % растений;

в поле (первая полевая репродукция) — не менее чем от 50 растений с гектара.

В питомниках отбора исходных растений отбирают листья с каждого растения, намечаемого к отбору.

1.3.4. От партии клубней, выращенных в поле или теплице, пробы для клубневого и иммуноферментного анализов отбирают по ГОСТ 11856 с учетом следующих дополнений.

При реализации клубней по счету количество точечных проб отбирают в соответствии с требованиями табл. 1.

Издание официальное Перепечатка воспрещена

© Издательство стандартов, 1992 © СТАНДАРТИНФОРМ, 2010

Таблица 1

Размер точечной пробы для ИФА — не менее 20 ютубней, объединенной пробы — не менее 200 клубней.

1.4. Клубни, отобранные для проведения иммуноферментного и клубневого анализов (за исключением больных и поврежденных), после проведения анализов присоединяют к исследуемой партии.

1.5. При разногласиях по результатам анализов проводят повторный контроль на вновь отобранной по п. 1.3.3 или 1.3.4 удвоенной пробе.

1.6. Результаты повторного контроля являются окончательными.

1.7. Результаты проверки распространяют на всю партию.

2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА

2.1. Качество оздоровленного исходного материала определяют методами: визуальной оценки растений, клубневого анализа и иммуноферментного анализа показателей скрытой зараженности вирусной и бактериальной инфекциями. Наличие бактериальной инфекции определяют только в сомнительных случаях (при нечетких внешних симптомах и при повышенной чувствительности сорта к бактериозам).

При завозе картофеля из хозяйств, где встречается стеблевая нематода, после проведения клубневого анализа при неясном ее определении проводят дополнительную диагностику тепличного и полевого материалов на наличие стеблевой нематоды вороночным методом.

2.2. Аппаратура

2.2.1. Инструменты и материалы для проведения клубневого анализа — по ГОСТ 11856.

2.2.2. При проведении ИФА используют: полистирольные 96-луночные микроплаты;

пипетки-дозаторы отечественного или зарубежного производства объемом 0,002—0,02 см³, 0,02-0,2 см³, 0,2-1,0 см³ по ГОСТ 1770, ГОСТ 6859;

пипетки стеклянные вместимостью 1 — 10 см³ по ГОСТ 29227; ступку фарфоровую диаметром 5 см по ГОСТ 9147; фотометры АИФ-Ц-01С, АКИ-С-01; набор реактивов для ИФА;

приспособление для отжатия соков — пресс электрический, ножной или ручной по ГОСТ 7236*; приемники для листьев (пластмассовые патроны, трубчатые контейнеры, ячеистые ящики, планшеты из пленки или ткани с кармашками);

посуду мерную вместимостью 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01 дм³ по ГОСТ 1770;

весы аналитические или торсионные по ГОСТ 29329**;

термостат;

холодильник бытовой по ГОСТ 26678;

приемники для выжатого сока (пробирки, пластины с углублениями) по ГОСТ 19908.

2.2.3. При диагностике стеблевой нематоды используют: микроскоп или бинокуляр по ГОСТ 8074; скальпель или нож столовый;

воронки диаметром 10—15 см;

пробирки диаметром 1,0—1,2 см, длиной 5—6 см по ГОСТ 19908; ткань капроновую (размер ячеек 0,5—2,0 мм) по ГОСТ 23114; марлю по ГОСТ 11109 или молочные (ватные) фильтры; синьку метиленовую; стекла предметные по ГОСТ 9284.

⁵¹¹ На территории Российской Федерации в части разд. 4, 6 действует ГОСТ Р 52786—2007, в части разд. 2, 3, 5, приложений 1, 2 ГОСТ Р 52787—2007.

** На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228—2008.

2.3. Метод визуальной оценки

2.3.1. Метод заключается в диагностике зараженности растений и клубней по признакам, видимым невооруженным глазом. При тщательном осмотре выявляют патологические отклонения от нормы по окраске, форме и фактуре листьев, стеблей, общему развитию куста, пробирочного растения, форме и окраске клубней.

2.3.2. Визуальную оценку оздоровленного исходного материала проводят:

непосредственно перед реализацией в соответствии с требованиями и. 1.3.1 — для растений in vitro;

во время приемки в установленном порядке — для посадок в поле;

сплошным осмотром растений — в теплице;

при клубневом анализе — для клубней.

Результаты оценки в поле, теплице оформляют актом приемки исходного оздоровленного материала (см. приложение 3).

2.3.3. Описания основных внешних признаков грибных, бактериальных и функциональных (непаразитарных) болезней клубней картофеля приведены в ГОСТ 11856, вирусных болезней растений и клубней — в приложениях 4, 5.

2.4. Метод клубневого анализа

2.4.1. Клубневой анализ проводят по ГОСТ 11856, определяя показатели качества в соответствии с требованиями ГОСТ 29268*.

2.4.2. Тепличные клубни разрезают только в сомнительных случаях.

2.5. Метод иммуноферментного анализа

2.5.1. Подготовка к анализу

2.5.1.1. Для проведения ИФА отбирают пробы:

на вирусы — листовой материал (проба листьев с верхнего, среднего и нижнего ярусов растений) или ростки клубней длиной 1—2 см;

на бактерии — стебли длиной 5—10 см, срезанные во время уборки на уровне корневой шейки, или кусочки ткани размером 1—2 см, вырезанные в столонной части клубня.

Пробирочные растения диагностируют только на вирусы.

2.5.1.2. Клубни проращивают при температуре 18—20 °С до появления ростка длиной 1—2 см. Если клубни находятся в состоянии глубокого покоя, то его прерывают обработкой в парах риндита (1 см³ на 1 кг клубней) в течение 48 ч при температуре 25 °С в герметической камере или обработкой раствором с ростовыми веществами — (10 г тиомочевины и 5 мг гиббереллина на 1 дм³ воды) в течение 20—30 мин.

2.5.1.3. Отобранные пробы (листья, кусочки стеблей или клубней) измельчают до кашицеобразного состояния в ступке или отжимают сок прессом.

2.5.1.4. Приготовление рабочих растворов из набора реактивов для ИФА

2.5.1.4.1. Приготовление покровного буфера. Содержимое флакона «покровный буфер» растворяют в 100 см³ дистиллированной воды.

2.5.1.4.2. Приготовление антител. 0,1 см³ концентрированного раствора антител разводят в 10 см³ покровного буфера. Для приготовления концентрированного раствора антител сухое содержимое флакона с этикеткой «антитела» растворяют в 1 см³ покровного буфера.

2.5.1.4.3. Приготовление промывочного буфера. Содержимое флакона с этикеткой «промывоч -ный буфер» растворяют в 2 дм³ дистиллированной воды, добавляют 0,5 см³ детергента на 1 дм³ буферного раствора.

2.5.1.4.4. Приготовление буфера для проб и разведения конъюгата. К 250 см³ промывочного буфера добавляют 1,0 г бычьего сывороточного альбумина (содержимое флакона).

2.5.1.4.5. Приготовление конъюгата. 0,02 см³ концентрированного раствора из флакона «конъюгат» смешивают с 10 см³ пробно-конъюгатного буфера.

2.5.1.4.6. Приготовление положительного контроля. Содержимое флакона «положительный контроль» растворяют в 1 см³ пробно-конъюгатного буфера.

2.5.1.4.7. Приготовление субстрата. 1 объем буферного концентрата из флакона «субстратный буфер» разбавляют 4 объемами дистиллированной воды. В 10 см³ буферного раствора растворяют 4 мг содержимого флакона «субстрат».

⁵¹¹ На территории Российской Федерации рекомендуется использовать ГОСТ Р 53136—2008.

Одну таблетку перекиси водорода растворяют в 20 см³ дистиллированной воды. К 10 см³ раствора добавляют 0,05 см³ раствора перекиси водорода.

2.5.1.5. Сок или измельченную ткань разводят буфером для проб и конъюгата в соотношении

1:10.

2.5.2. Проведение анализа

Наливают по ОД см³ рабочего раствора антител в лунки платы, накрывают ее крышкой и инкубируют в течение 15—16 ч при температуре 4 °С или 2 ч при температуре 37 °С в термостате.

Удаляют раствор из платы резким переворачиванием или вытряхиванием.

Трижды промывают лунки промывочным буфером.

Тщательно удаляют раствор из лунок легкими ударами перевернутой платой по листу фильтровальной бумаги.

В лунки платы наносят по 0,1 см³ жидкости: в одну из лунок вносят «отрицательный» контроль, в другую «положительный», в остальные — разведенный буферный экстракт анализируемых проб.

Накрывают плату крышкой и инкубируют 1 ч при 37 °С.

Лунки промывают промывочным буфером трижды.

Наливают 0,1 см³ рабочего раствора конъюгата в лунки платы, накрывают крышкой и инкубируют 1 ч при 37 °С.

Лунки промывают промывочным буфером пять раз.

Наливают по 0,1 см³ субстрата в лунки и инкубируют при комнатной температуре в течение 5—10 мин для развития окраски, после чего реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,50 см³ трехмолярного раствора серной кислоты.

Наличие вирусной или бактериальной инфекции определяют по интенсивности окрашивания в лунках плат с помощью фотометра при длине волны 490 нм или визуально.

2.5.3. Обработка результатов

2.5.3.1. При фотометрической оценке получают числовые значения оптической плотности (Л₄₉₀) окрашенного продукта ферментативной реакции в оптических единицах (О.Е). Порог достоверности положительных результатов (Р) вычисляют по формуле

Р = Х+ ЗЕ,

где: X — среднее значение Л₄₉₀ отрицательного контроля (здоровый материал);

3Е — тройное значение максимального отклонения А₄₉₉ от среднего в отрицательном контроле.

Все значения А₄₉₀ выше значения порога достоверности положительных результатов (Р) считают положительными результатами.

2.5.3.2. При визуальной оценке, дающей информацию «да» или «нет», применяют следующую шкалу:

вирус отсутствует — едва заметное окрашивание (как в отрицательном контроле);

материал заражен — слабое, но заметное окрашивание, отличное от отрицательного контроля;

материал сильно заражен — интенсивное окрашивание, как в положительном контроле, или более интенсивное.

2.5.4. Иммуноферментный анализ тепличных и полевых растений картофеля проводят во время бутонизации или в начале цветения, пробирочных — в фазе 4—5 междоузлий, клубней —перед реализацией.

2.6. Вороночный метод

Отобранные клубни тщательно моют в воде.

Анализируемую часть клубня измельчают ножом на мелкие кусочки размером 4—5 мм и кладут на капроновую ткань, марлю (три слоя) или в молочные фильтры.

На конец воронки надевают резиновую трубку, к другому концу которой прикрепляют пробирку и устанавливают в штатив.

Воронку заполняют водой, нагретой до 25—30 °С (не доливая 1 см до края).

В воронку с водой осторожно погружают капроновую сетку с кусочками клубня и оставляют на 4-5 ч.

Отсоединяют пробирку, осторожно выливают воду, а осадок переносят на предметное стекло.

Осадок из пробирки просматривают под бинокуляром или микроскопом.

При возникновении сомнений в отношении диагностики стеблевой нематоды осадок подкрашивают 0,25—1 %-ным раствором метиленовой синьки. В этом растворе все сапробиотические нематоды через 10—15 мин окрашиваются в синий цвет. Фитогельминты, в том числе и стеблевая нематода картофеля, не окрашиваются.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Обязательное

АТТЕСТАТ

на оздоровленный исходный семенной материал картофеля культуры in vitro

1. Наименование хозяйства, учреждения, выдавшего аттестат_

2. Почтовый адрес_

3. Ботанический сорт_

4. Вид материала в партии (растения в пробирках, микроклубни)_

5. Количество материала (шт.)_

6. Основание к выдаче аттестата:

Иммуноферментный анализ № _

от «_» _ 20 _ г.

Проверка методом ИФА свидетельствует о полном отсутствии вирусов X, S, М, Y, L, А.

7. Обозначенная партия соответствует предъявляемым ГОСТ_требованиям и передана

в адрес_

Поставщик

Подпись

«

»

20 г.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Обязательное

АТТЕСТАТ

на оздоровленный исходный клубневый материал картофеля тепличный, полевой

ненужное зачеркнуть

1. Наименование хозяйства, учреждения, выдавшего аттестат_

2. Почтовый адрес_

3. Ботанический сорт _

4. Метод получения исходного материала_

5. Масса партии (кг, т) или количество (шт.)_

6. Размер клубней от_мм до_мм

7. Сведения о качестве на основании акта приемки исходного оздоровленного материала, акта клубневого

анализа картофеля №_ от _ 20_г. и иммуноферментного

анализа клубней № _ от _ 20_ г.;

при визуальной оценке внешне больных растений, %_

зараженность растений по результатам ИФА, %_

зараженность клубней по результатам ИФА, %_

зараженность клубней по результатам клубневого анализа, %_

8. Обозначенная партия картофеля соответствует ГОСТ_и передана в адрес

Гарантия

Семенной материал во время уборки, хранения и отгрузки не засорен другими сортами и не смешан с картофелем того же сорта, но другого происхождения

Руководитель учреждения_ Подпись

Агроном-семеновод_ Подпись

«

»

20 г.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Обязательное

АКТ

приемки оздоровленного исходного материала в теплице (поле)

наименование учреждения, организации

Комиссия в составе

наименование организаций, должность,

фамилия, инициалы

в присутствии представителя хозяйства_

ознакомилась с документацией, результатами предварительной оценки растений и осмотрела посадки сорта

_происхождения_

с целью определения соответствия их по качеству ГОСТ_

Результаты оценки:

Всего растений, шт. _

площадь, га _

сортовая чистота _

При визуальной оценке внешне больных растений, %, всего_

в том числе:

пораженных бактериальными болезнями_

тяжелыми вирусными _

вызванными почвенными вирусами _

вироидными _

легкими вирусными _

Скрытая зараженность растений по результатам, ИФА, %,

всего _

в том числе:

вирусами: X, S, М _

Y, L, А_

бактериальной инфекцией_

Заключение комиссии о соответствии посадок требованиям ГОСТ

соответствует, не соответствует

Члены комиссии

Подписи

« »

20 г.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Справочное

ВНЕШНИЕ ПРИЗНАКИ ОСНОВНЫХ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Справочное

ВНЕШНИЕ ПРИЗНАКИ НЕКОТОРЫХ ВИРУСНЫХ И ВИРОИДНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КАРТОФЕЛЯ

НА КЛУБНЯХ

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Научно-исследовательским институтом картофельного хозяйства (НИИКХ) НПО по картофелеводству

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 29.12.91 № 2386

3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июнь 2010 г.