ГОСТ 27318-87
(CT СЭВ 5627-86)
Группа С79
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
Методы идентификации атипичных микобактерий
Agricultural animals. Methods of identification of non-typical microbacteria
ОКСТУ 9809
Срок действия с 01.01.88
до 01.01.93*
______________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу N б/н Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 2, 1993 год). - .
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР
ИСПОЛНИТЕЛИ
Н.П.Овдиенко, канд. вет. наук (руководитель темы); А.М.Кадочкин, канд. вет. наук; В.И.Косенко, канд. вет. наук; В.А.Шаров, канд. вет. наук; А.Н.Шаров, канд. вет. наук; В.С.Тырина, канд. биол. наук; Б.И.Антонов; Э.С.Плотников; А.В.Ткаченко-Кузьмин, канд. вет. наук
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 02.06.87 N 1797.
3. СРОК ПРОВЕРКИ - 1992 г.
ПЕРИОДИЧНОСТЬ ПРОВЕРКИ - 5 ЛЕТ
4. СТАНДАРТ ПОЛНОСТЬЮ СООТВЕТСТВУЕТ СТ СЭВ 5627-86
5. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
6. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер пункта, подпункта, перечисления, приложения |
ГОСТ 429-76 | 3.6.2
|
2.2, 3.3.2, 3.4.2, 3.6.2. 3.7.1
| |
1.2, 3.3.2
| |
2.2, 3.3.2
| |
2.2, 3.7.1, 4.2
| |
1.2, 3.6.2
| |
3.6.2
| |
1.2, 2.2, 4.2
| |
1.2, 2.2
| |
ГОСТ 6417-72 | 1.2, 3.6.2, 4.2, 5.2
|
1.2, 2.2, 3.3.2, 3.4.2, 3.6.2, 3.7.1, 4.2, 5.2
| |
ГОСТ 8284-78 | 1.2, 4.2
|
| 4.2
|
| 1.2, 4.2
|
| 3.3.2
|
| 1.2, 4.2
|
ГОСТ 20292-74
| 2.2, 3.4.2, 3.7.1, 5.2
|
ГОСТ 23683-79
| 2.2
|
ГОСТ 24104-80
| 1.2, 2.2, 3.6.2, 3.7.1, 4.2
|
| 3.3.2, 3.6.2
|
1.2 |
Настоящий стандарт устанавливает бактериоскопический, культуральный, биохимический, биологический и серологический методы идентификации атипичных микобактерий.
Стандарт применяют при идентификации атипичных микобактерий в ветеринарных лабораториях научно-исследовательских учреждений и республиканских производственных ветеринарных лабораториях.
1. БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД
1.1. Сущность метода заключается в способности микобактерий, окрашенных фуксином, удерживать краситель после длительного обесцвечивания в соляно-кислом спирте.
1.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
микроскопы биологические марки МПИ или МРП по ГОСТ 8284-78;
осветитель;
горелку газовую или спиртовую;
стекла предметные;
часы песочные на 5 мин;
петли бактериологические;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;
пинцет;
бумагу фильтровальную;
фенол по ГОСТ 6417-72;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;
кислоту соляную концентрированную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а.;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а.;
калия гидроокись по ГОСТ 24363-80, ч.д.а.;
фуксин основной;
глицерин по ГОСТ 6259-75;
масло иммерсионное по ГОСТ 13739-78;
ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный;
фуксин Циля карболовый, раствор; готовят следующим образом: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см этилового спирта. После растирания краски прибавляют при постоянном помешивании 90 см дистиллированной воды. Раствор краски через 24 ч фильтруют через бумажный фильтр.
Карболовый раствор фуксина хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
метиленовую синь;
культуры микобактерий;
соляно-кислый спирт, раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 3%; готовят следующим образом: 3 см концентрированной соляной кислоты добавляют к 97 см 96%-ного этилового спирта;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
1.3. Проведение испытаний
Из отдельной колонии изучаемой культуры готовят тонкий мазок на предметном стекле, который высушивают при комнатной температуре и фиксируют над пламенем. На фиксированный препарат кладут узкую полоску фильтровальной бумаги, закрывающую мазок полностью.
На полоску фильтровальной бумаги наливают карбол фуксина Циля и нагревают до появления паров (два-три раза) в течение 5 мин (не доводя краску до кипения). Раствор краски при этом каждый раз добавляют. Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумагу, сливают избыток красителя и препарат промывают проточной водой.
Для обесцвечивания на предметное стекло наливают раствор соляно-кислого спирта до тех пор, пока он без окрашивания будет стекать с предметного стекла.
После обесцвечивания препарат тщательно промывают водой и окрашивают метиленовой синью в течение 3-5 мин. Затем препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают в световом микроскопе с иммерсией.
1.4. Оценка результатов
Нахождение в поле зрения микроскопа кислотоустойчивых микобактерий и отсутствие посторонних микроорганизмов является показателем чистоты испытуемой культуры.
У быстрорастущих культур микобактерий IV группы по Раньону наряду с кислотоустойчивыми встречаются и некислотоустойчивые формы микобактерий.
2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
2.1. Сущность метода заключается в получении при пересевах единичных колоний, определении морфологии и характера роста микобактерий на питательных средах.
2.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;
горелку газовую или спиртовую;
петли бактериологические;
термостат с автоматическим регулированием температуры;
автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см);
шкаф сушильный электрический для стерилизации лабораторного стекла с диапазоном изменения температуры от 50 до 220°С;
аппарат Коха для стерилизации питательных сред текучим паром;
рН-метр 340;
аппарат для встряхивания;
центрифугу лабораторную с частотой вращения 3000 мин;
лупу с увеличением и ;
штативы металлические для пробирок диаметром 16 мм;
пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;
пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;
палочки стеклянные;
пробки ватно-марлевые;
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,85%;
магний лимоннокислый, ч.д.а.;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;
магний сернокислый, ч.д.а.;
парафин по ГОСТ 23683-79;
L-аспарагин;
глицерин по ГОСТ 6259-75;
малахитовая зелень, раствор с массовой долей 2%;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67 с массовой долей 96 и 70%;
среду Левенштейна-Йенсена; готовят следующим образом: 2,4 г однозамещенного фосфорнокислого калия, 0,24 г магния сернокислого, 0,6 г магния лимоннокислого, 3,6 г L-аспарагина, 12 см глицерина растворяют в указанной последовательности в 600 см воды при слабом подогревании и стерилизуют в течение 2 ч текучим паром. К раствору добавляют 100 см яичной массы. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, добавляют 200 см стерильного 2%-ного раствора малахитовой зелени и разливают в пробирки приблизительно по 5 см. Свертывание проводят при 85°С в течение 45 мин.
Яичную массу готовят из свежих диетических яиц, вымытых проточной теплой водой щеткой с мылом. Вымытые яйца погружают на 30 мин в 70%-ный спирт, а затем над спиртовкой в боксе разбивают стерильным пинцетом в колбу со стеклянными шариками и хорошо перемешивают;
бульон мясо-пептонный (МПБ);
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
Примечания:
1. Для контроля стерильности указанные среды помещают в термостат с температурой 37-38°С на 2 сут.
2 При посевах используют среды, приготовленные не более чем за 14 сут до испытания.
2.3. Проведение испытания
С целью получения единичных колоний и учета скорости роста при разных температурных режимах, а также характера роста на мясо-пептонном бульоне с поверхности отдельной колонии берут 2-5 мг испытуемой культуры микобактерий и помещают в стерильную пробирку с 1-2 см раствора хлористого натрия с массой долей 0,85%.
Взятую массу микобактерий растирают стеклянной палочкой по стенке пробирки и добавляют раствор хлористого натрия до концентрации 1 мг/см.
Взвесь культуры микобактерий высевают с помощью пипетки диаметром 3-4 мм в пять пробирок со средой Левенштейна-Йенсена и в две пробирки с мясо-пептонным бульоном. Обе пробирки с мясо-пептонным бульоном и одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 37-38°С. По одной пробирке со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 25 и 45°С. Две оставшиеся пробирки со средой Левенштейна-Йенсена ставят в термостат при 37-38°С для изучения пигментообразования.
Учет роста при различных температурах оценивают, разместив пробирки с питательными средами, инкубированными при различных температурах, рядом друг с другом, и сопоставив развитие отдельных колоний.
При оценке регистрируют, на какой питательной среде и в какой срок появляется колония бактерий, и какова ее пигментированность.
2.4. Оценка результатов
Колонии, выросшие на среде Левенштейна-Йенсена до 7 сут, а также образовавшие в течение этого срока на мясо-пептонном бульоне кольцо или пленку относят к группе IV по Раньону.
Колонии, развившиеся в сроки свыше 7 сут, относят к группам I, II и III по Раньону.
Культуры М. bovis или М. tuberculosis растут медленнее (от 21 до 70 сут).
Медленно растущие скотохромогенные микобактерии и микобактерии комплекса aviurn*-intracellulare образуют придонный рост, а микобактерии комплекса nonchromogenicum преимущественно образуют кольцо или пленку на поверхности среды в более поздние сроки.
_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. - .
3. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД
3.1. Сущность метода заключается в определении вида культуры или отдельного комплекса микобактерий на основании изучения их биохимических свойств путем применения отдельных тестов.
3.2. Тест - пигментообразование
3.2.1. Сущность теста заключается в образовании культурой пигмента в различных условиях: в темноте и на свету.
Исследованию подвергаются только медленно растущие культуры.
3.2.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
лампу электрическую мощностью 100 Вт;
термостат с автоматическим регулированием температуры;
бумагу светонепроницаемую;
культуры микобактерий;
среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2;
бульон мясо-пептонный.
3.2.3. Проведение испытания
Микробную массу в разведении соответственно 10, 10 и 10 вносят в две пробирки питательных сред. Одну пробирку с питательной средой инкубируют, завернув ее в светонепроницаемую бумагу, при полном отсутствии света при температуре 25, 37 и 45°С в течение трех недель. Другую пробирку подвергают освещению в течение 1 ч на расстоянии 1 м от источника света мощностью 100 Вт и инкубируют в течение 7 и 12 сут при тех же температурных режимах и сроках.
По истечении трех недель регистрируют выросшие на двух питательных средах колонии и их пигментированность.
3.2.4. Оценка результатов
Если колонии за время инкубирования выделили пигмент, то культуру относят к группе I по Раньону (фотохромогенная группа). Если культура образовала пигмент при полном отсутствии света, то ее относят к группе II по Раньону (скотохромогенная).
Если культура не выделила пигмента, то ее относят к группе III по Раньону (нефотохромогенная группа).
3.3. Тест - редукция нитратов
3.3.1. Сущность теста заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного из нитрата нитрита, определении микобактерий по изменению окраски.
3.3.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
лопатку платиновую;
термостат с автоматическим регулированием температуры;
автоклав электрический с рабочим давлением 0,15 МПа (1,5 кгс/см);
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24204-80;
рН-метр 340;
пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;
натрий фосфорнокислый двухзамещенный по ГОСТ 11773-76, ч.д.а.;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, ч.д.а.;
парадиметиламинобензальдегид, раствор с массовой долей 2% в растворе соляной кислоты с массовой концентрацией 10%;
кислоту соляную по ГОСТ 3118-77, х.ч. или ч.д.а.; раствор с массовой концентрацией соляной кислоты 10%;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
3.3.3. Подготовка к испытанию
Готовят фосфатный буферный раствор следующим образом:
растворяют 9,47 г двухзамещенного фосфорнокислого натрия в 1 дм (раствор 1);
растворяют 9,05 г однозамещенного фосфорнокислого калия в 1 дм воды (раствор 2).
Для получения 100 см фосфатного буфера к 61,1 см раствора 1 добавляют 38,9 см раствора 2 (рН 7,0). Полученный раствор разливают по 4 см в пробирки и при 120°С автоклавируют в течение 15 мин. Раствор помещают в термостат при 37°С на 24 ч, после чего проверяют на стерильность.
3.3.4. Проведение испытания
В 1 см фосфатного буфера суспензируют 10 мг (одна платиновая лопатка) испытуемой культуры и инкубируют при 37-38°С в течение 15-16 ч.
Образование нитрата проверяют добавлением 2 капель раствора парадиметиламинобензальдегида.
3.3.5. Оценка результатов
Появление желтой окраски свидетельствует о положительной реакции. Для контроля используют виды микобактерий, дающие положительную и отрицательную реакцию на редукцию нитратов.
3.4. Тест - активность каталазы
3.4.1. Сущность теста заключается в способности клеток микобактерий образовывать в процессе роста фермент каталазу, количество которой различно у разных видов микобактерий. Каталаза разлагает перекись водорода на воду и молекулярный водород.
3.4.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
линейку измерительную;
пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 5 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;
петлю бактериологическую;
пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;
культуры микобактерий;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
3.4.3. Проведение испытания
В пробирку с культурой, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена при 37°С и имеющей не менее 10 мг бактериальной массы, вносят разбавленную в соотношении 1:1 водой перекись водорода в таком количестве, чтобы при наклонном положении она полностью перекрывала культуру микобактерий. Имеющееся в пробирке до внесения раствора незначительное количество конденсационной жидкости не удаляют.
Оценку реакций проводят по интенсивности образования пузырьков кислорода, образующихся в течение 5 мин после добавления раствора к культуре, и измеряют высоту столбика пены в миллиметрах при вертикальном положении пробирки.
3.4.4 Оценка результатов
Положительной реакция считается, если образуется столбик пены высотой 45 мм и более, отрицательный - если высота столбика пены менее 45 мм или если не происходит образования пузырьков кислорода в течение 5 мин.
3.5. Тест - аккумуляция железа
3.5.1. Сущность теста заключается в способности испытуемых культур изменять свой цвет при воздействии лимонно-аммиачного железа.
3.5.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
термостат с автоматическим регулированием температуры;
петлю бактериологическую;
железо лимонно-аммиачное;
культуры микобактерий;
среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2.
3.5.3. Проведение испытания
К питательной среде Левенштейна-Йенсена добавляют лимонно-аммиачное железо в таком количестве, чтобы конечная концентрация его составляла 2%. На эту среду высевают испытуемые культуры и выдерживают в течение 7 сут при температуре 37°С.
3.5.4. Оценка результатов
Реакция считается положительной, если культура окрашиваются в коричневый цвет, отрицательной - если культура остается прежнего цвета.
3.6. Тест - амидазная активность
3.6.1. Сущность теста основана на дезаминировании амидов и выделении аммиака, определяемого специальными реактивами.
3.5.4.* Оценка результатов
_________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - .
Для проведения испытаний применяют:
автоклав;
культуры микобактерий;
петлю бактериологическую;
пробирки бактериологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;
аппарат Коха;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;
фильтр Зейтца;
марганец сернокислый по ГОСТ 429-76, ч.д.а.;
фенол по ГОСТ 6417-72;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,5%;
гипохлорит кальция, ч.д.а., раствор с массовой долей 1%;
кальций углекислый по ГОСТ 4530-76, ч.д.а., раствор с массовой долей 20%;
реактив Русселя, состоящий из трех компонентов (раствора сульфата марганца, фенолового раствора и раствора гипохлорита кальция). Компоненты готовят следующим образом:
раствор сульфата марганца - 66,9 мг сульфата марганца растворяют в 100 см воды;
феноловый раствор - 12,5 г фенола в 5 см воды взбалтывают и приливают 25 см раствора гидроокиси натрия с массовой долей 0,5%, взбалтывают до полного растворения фенола и доводят объем водой до 50 см;
раствор гипохлорита - к 300 см нагретой до 90°С воды прибавляют 25 г гипохлорита кальция, взбалтывают и прибавляют 135 см раствора углекислого кальция с массовой долей 20%. Доводят до кипения на несколько минут, чтобы дать аммиаку улетучиться. Полученный раствор охлаждают и доводят объем водой до 500 см.
амидный ряд: ацетамид, бензамид, карбамид, изоникотинамид, никотинамид, пиразинамид, салициламид, аллантоин, сукцинамид, мелонамид;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
3.6.3. Проведение испытания
Из каждого амида готовят раствор из расчета 400 мг/см, стерилизуют в течение 20 мин при 100°С, а карбамид - фильтрацией через фильтр Зейтца.
0,5 см взвеси испытуемых микобактерий плотностью 20 мг/см разливают в три ряда стерильных пробирок (по 10 пробирок в каждом ряду).
10 пробирок из первого ряда в течение 20 мин выдерживают при 100°С для инактивации бактерий. Затем в три пробирки каждого вертикального ряда добавляют последовательно перечисленные амиды в количестве 0,5 см. Пробирку инкубируют в течение 10 ч при 37°С, а затем в каждую пробирку вносят растворы реагентов в следующей последовательности:
а) 0,2 см сернокислого марганца;
б) 2,0 см раствора фенола;
в) 1,0 см раствора гипохлорита натрия с массовой долей 1%.
После внесения растворов реагентов пробирки хорошо встряхивают и выдерживают в течение 20 мин при 100°С. Учет реакций проводят через 60 и 90 мин.
3.6.4. Оценка результатов
Реакцию оценивают визуально и считают положительной, если в пробирке образуется сине-зеленое окрашивание.
3.7. Тест - рост на среде с содержанием хлористого натрия с массовой долей 5%
Сущность теста основана на способности атипичных быстрорастущих микобактерий (IV группа по Раньону) и М. triviale (III группа по Раньону) расти на среде, содержащей хлористый натрий.
3.7.1. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
термостат с автоматическим регулированием температуры;
горелку газовую или спиртовую;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;
пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;
пробирки бактериологические стеклянные вместимостью 10 см по ГОСТ 1770-74;
бактериологические петли;
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, раствор с массовой долей 5%;
среду Левенштейна-Йенсена по п.2.2;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
3.7.2. Проведение испытания
К 100 см питательной среды Левенштейна-Йенсена прибавляют 5 г хлористого натрия и хорошо смешивают перед свертыванием среды. Затем питательную среду разливают по 3-3,5 см в бактериологические пробирки. Подобным способом готовят и контрольные пробирки со средой, не содержащей хлористого натрия.
На питательную среду, содержащую хлористый натрий, и на среду без него высевают по 0,2 см исследуемой культуры плотностью 2-3 мг/см.
Культуру сначала инкубируют при 35°С с ослабленной пробкой до испарения влаги с поверхности питательной среды, затем пробирки плотно закрывают и продолжают инкубацию в течение 6 недель.
3.7.3. Оценка результатов
Если в течение указанного времени появляется более 50 колоний на питательной среде, содержащей хлористый натрий, культуру считают толерантной, если менее 50 колоний - резистентной к содержанию хлористого натрия.
В контрольных пробирках должен быть хороший рост культур в виде множественных сливающихся колоний.
4. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ М. avium от М. intracellulare
4.1. Сущность метода заключается в воспроизведении туберкулеза при введении кроликам и курам культур М. avium.
4.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;
микроскопы биологические марки МБИ или МРБ по ГОСТ 8284-78;
осветитель;
горелку газовую или спиртовую;
часы песочные по 5 мин;
шприцы вместимостью 1-2 см;
иглы инъекционные;
стекла предметные по ГОСТ 9284-75;
флаконы стеклянные вместимостью 10 см;
петли бактериологические;
бумагу фильтровальную;
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, ч.д.а., раствор с массовой долей 0,85%;
турберкулин для птиц;
культуры микобактерий;
фенол по ГОСТ 6417-72;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;
фуксин карболовый по п.1.2;
масло иммерсионное по ГОСТ 13739-79*;
________________
* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 13739-78. - .
ксилол по ГОСТ 9410-78 или бензин авиационный;
метиленовую синь;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
4.3. Подготовка к испытанию
Приготавливают взвесь из культуры микобактерий, ранее отнесенной по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам к комплексу avium-intracellulare. Бактерийную массу в количестве 8-10 мг снимают шпателем с поверхности плотной питательной среды и переносят в стерильный флакон с резиновой пробкой, предварительно взвешенный на аналитических весах. Затем флакон вновь взвешивают и по разности между первой и массой флакона определяют массу взятой культуры. Во флаконы добавляют раствор хлористого натрия с массовой долей 0,85% из расчета 1 см на 1 мг бактерийной массы.
4.4. Проведение испытания
Для постановки биологической пробы берут двух кроликов массой 2000 г и двух кур в возрасте 5 мес, не реагирующих на введение туберкулина.
Взвесь культуры в дозе 1 см вводят кроликам в краевую вену уха, курам - в подкрыльцовую вену.
За лабораторными животными, которым введена испытуемая культура, устанавливают наблюдение в течение 90 сут.
При развитии туберкулезного процесса у кроликов и кур после введения им взвеси культуры наблюдается истощение, снижение аппетита. В случае отсутствия падежа животных убивают через 90 сут. Павших или убитых животных вскрывают и проводят осмотр внутренних органов. Из органов готовят мазки по п.1.3. Просмотр мазков проводят с помощью иммерсионной системы микроскопа.
4.5. Оценка результатов
Микобактерии птичьего вида у кроликов вызывают сепсис (тип Йенсена), характеризующийся резким увеличением селезенки. При этом гибель животного наступает через 13-30 сут.
М. avium при внутривенном заражении кур вызывают в большинстве случаев гибель их в течение 30 сут. Иногда куры выживают от 10 до 90 сут. На вскрытии павших или убитых кур обнаруживают много серо-желтых бугорков в печени и селезенке, а в мазках из них - значительное количество микобактерий туберкулеза.
5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
5.1. Сущность метода заключается в определении сероваров М. avium и М. intracellulare в реакции прямой агглютинации (РА) по методу Шефера с гипериммунными сыворотками, дающими положительные результаты с гомологичными антигенами.
5.2. Средства испытаний
Для проведения испытаний применяют:
пластинки плексиглазовые с лунками;
штативы;
пипетки градуированные исполнений 1, 2, 4, 5, 6 вместимостью 1, 5 и 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 20292-74;
рН-метр 340;
раствор буферный фосфатный, рН 7,1;
гипериммунные кроличьи сыворотки комплекса avium-intracellulare различных сероваров;
фенол по ГОСТ 6417-72, водный раствор с массовой долей 0,5%;
антигены - живые культуры микобактерий;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72.
5.3. Подготовка к испытанию
Для серологической реакции используют культуры микобактерий, выросших в S форме.
В качестве антигена для реакции агглютинации применяют бактерийную массу культур микобактерий, выращенную на питательной среде в течение 21 сут.
Антиген готовят на фосфатном буферном растворе накануне проведения испытания в концентрации 0,3 мг/см с добавлением 0,5%-ного водного раствора фенола. Гипериммунные сыворотки разводят в рабочем разведении на том же растворе.
5.4. Проведение испытания
Для каждой культуры микобактерий берут по две разные сыворотки одинакового серовара. Разведенные сыворотки сероваров микобактерий комплекса avium-intracellulare в рабочем титре разливают в дозе 0,5 см в лунки вертикального ряда, за исключением последней лунки, которая служит для контроля. В горизонтальные ряды гнезд разливают по 0,5 см взвеси определяемых культур микобактерий.
В контрольные лунки наливают по 0,5 см фосфатного буфера и по 0,5 см взвеси микобактерий.
Пластинки без встряхивания помещают в термостат и инкубируют при 37°С в течение 20 ч.
Учет реакции проводят через 4 и 20 ч.
5.5. Оценка результатов
Результаты реакции оценивают в крестах:
4 креста - все агглютинационные частицы в виде зонтика осаждены на дно лунки, а надосадочная жидкость совершенно прозрачна;
3 креста - на дне лунки образовался агглютинационный зонтик, а в надосадочной жидкости наблюдается некоторая опалесценция;
2 креста - агглютинационные частицы находятся в жидкости;
1 крест - имеются следы агглютинации;
контроль - агглютинация отсутствует.
Положительной реакцией считают агглютинацию, выраженную в 4 или 3 креста, сомнительной - 2 или 1 крест и отрицательной - отсутствие агглютинации.
Схема изучения микобактерий и основные свойства видов или комплексов микобактерий приведены в приложении.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное
Таблица 1
Основные свойства видов или комплексов микобактерий
Наиме- | Наименование видов и комплексов микобактерий | ||||||||||||||||||
нование показа- теля | M. tuberculosis | M. bovis | М. kansasil | М. marinum | M. simiae | M. serofula- ceum | М. gordonae | M. xenopi | M. avium- intracellulare | M. nonchromo- genicum | M. gastri | M. vaccae | M. fortuitum | M. chelonci | M. flavescens | M. thamnopheos | M. phlei | M. diernhoferi | M. smegmatis |
1. Скорость роста
| 21- 60 | 42- 70 | 10- 30 | 10- 30 | 10- 20 | 10- 20 | 10- 20 | 10- 20 | 11- 30 | 10- 30 | 10- 20 | 3-7 | 3-7 | 3-7 | 3-7 | 3-7 | 3-7 | 3-7 | 3-7 |
2. Рост на среде Левенштейна- Йенсена:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
при 25°С
| - | - | + | ± | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
при 37°С
| + | + | + | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
при 45°С
| - | - | - | - | - | - | - | - | ± | - | - | - | - | - | - | - | + | + | + |
3. Форма колоний
| R | R | R | R | R | S | S | R | S | R | S | S | R | R | S | S | R | S | S |
4. Рост на МПБ при 37°С
| - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
5. Окраска
| - | - | Ф | Ф | Ф | С | С | С | - | - | - | Ф/С | - | - | С | - | С | - | - |
6. Редукция нитратов
| + | - | + | - | + | - | - | - | - | + | - | ± | + | - | + | - | + | ± | + |
7. Аккумуляция железа
| - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | - | + | + | + | - |
8. Рост на среде с 5% хлористого натрия
| - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | - | + | - | + | |
9. Активность каталазы | - | - | + | - | + | + | + | + | ± | + | - | + | + | + | + | - | - | - | - |
Примечание. Буквы означают: Ф - фотохромогенная окраска (пигмент); С - скотохромогенная окраска (пигмент); R - шероховатая форма колоний; S - гладкая форма колоний.
Знак "+" означает показатель положительный; "-" - отрицательный; "" преимущественно отрицательный; "±" - преимущественно положительный.
Таблица 2
Схема изучения микобактерий
Наименование | M. | M. | Атипичные микобактерий (группы по Раньону) | |||||||
показателя | tuberculosis | bovis | I | II | III | IV | ||||
|
|
| М. kansasil | М. marinum | M. serofula- ceum | М. gordonae | Комплекс avium intracellulare | Комплекс nonchromo- genicum | Быстро- растущие микобак- терии | |
| (Кислотоустой- чивые палочки)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1. | Бактериоскопия
| + | + | + | + | + | + | + | + | + |
2. | Рост на среде Левенштейна- Йенсена: при 25°С
| - | - | + | + | + | + | ± | ± | + |
| при 37°С
| + | + | + | ± | + | + | + | + | + |
| при 45°С
| - | - | - | - | - | - | ± | ± | |
3. | Рост на МПБ:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| придонный
| - | - | ± | - | + | + | |||
| поверхностный
| - | - | + | - | - | - | ± | ||
4. | Пигментообра- зование:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| на свету
| - | - | - | + | + | + | - | - | ± |
| в темноте
| - | - | + | - | + | + | - | - | |
5. | Редукция нитратов
| + | - | + | - | - | - | - | + | ± |
6. | Активность каталазы | - | - | + | + | + | + | - | ± | + |
Примечание. Знак "+" означает показатель положительный; "-" - отрицательный; "" -преимущественно отрицательный; "±" - преимущественно положительный.
Электронный текст документа
и сверен по:
М.: Издательство стандартов, 1987