ГОСТ Р 55027-2012 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод

Обложка ГОСТ Р 55027-2012 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод
Обозначение
ГОСТ Р 55027-2012
Наименование
Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод
Статус
Действует
Дата введения
2014.01.01
Дата отмены
-
Заменен на
-
Код ОКС
07.100.30


ГОСТ Р 55027-2012/ISO/TS 10272-3:2010


Группа Н09


НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp.

Часть 3

Полуколичественный метод

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 3. Semi-quantitative method

ОКС 07.100.30

Дата введения - 2014-01-01


Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004* "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

________________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 1.0-2012. - .

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода на русский язык международного документа, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 октября 2012 г. N 555-ст

4 Настоящий стандарт является идентичным международному документу ИСО/ТУ 10272-3:2010* "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 3. Полуколичественный метод" (ISO/TS 10272-3:2010 "Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 3: Semi-quantitative method") с учетом технической поправки ISO/TS 10272-3:2010/Cor. 1:2011.

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .

Техническая поправка выделена в тексте (таблица 3) вертикальной чертой*.

______________

* В бумажном оригинале вертикальная черта в таблице 3 отсутствует. - .

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов и документов соответствующие им национальные стандарты Российской Федерации, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод полуколичественного определения Campylobacter spp.

Настоящий стандарт распространяется:

- на пищевую продукцию и корма для животных;

- на пробы окружающей среды в области производства и обращения пищевой продукции.

Настоящий стандарт не применяют при контроле некоторых видов пищевой продукции и кормов.

2 Нормативные ссылки

Следующие ссылочные нормативные документы* являются обязательными при применении данного стандарта. Для датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок применяется последнее издание стандарта (включая любые изменения).

____________

* Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. по ссылке. - .

ИСО 6887 (все части) Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований (ISO 6887 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination (all part))

ИСО 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям (ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations)

ИСО/ТУ 11133-1 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории (ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory)

ИСО/ТУ 11133-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по определению эффективности питательных сред (ISO/TS 11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

3.1 Campylobacter (Campylobacter) (Микробиология Campylobacter пищевых продуктов и кормов для животных): Род микроорганизмов, образующих характерные колонии на твердых селективных средах, когда их инкубируют микроаэробным способом при температуре 41,5 °С, но не при 25 °С, и которые обладают характерной подвижностью, биохимическими свойствами и способностью к росту, описанными в тех случаях, когда испытания проводятся в соответствии с настоящим стандартом.

Примечание - Наиболее часто встречающимися видами являются Campylobacter jejuni и С. coli. Вместе с тем были описаны и другие виды (С. lari, С. upsaliensis и некоторые другие).

3.2 полуколичественное определение (semi-quantitative determination) (Микробиология Campylobacter пищевых продуктов и кормов для животных): Определение уровня загрязнения Campylobacter в том случае, когда ожидается небольшое количество или если уровень сопутствующей флоры относительно высок.

4 Принцип

4.1 Общие положения

Для полуколичественного определения Campylobacter spp. необходимо выполнение операций, описанных в 4.2-4.4 (см.рисунок А.1).

4.2 Обогащение в селективной жидкой среде

Пробу для анализа и ее десятичные разбавления инокулируют или разбавляют в жидкой обогатительной среде (бульон Болтона) и гомогенизируют.

Обогатительную среду инкубируют при 37 °С в течение 4-6 ч и затем при 41,5 °С в течение (44±4)ч.

4.3 Изоляция и отбор для подтверждения

Из культур, полученных по 4.2, твердую селективную среду, основанную на модифицированном агаре с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (mCCD агар), инокулируют, инкубируют при 41,5 °С в микроаэробной атмосфере и проверяют после (44±4) ч с целью обнаружения присутствия колоний, которые по своим характеристикам предположительно являются Campylobacter spp.

4.4 Подтверждение

Колонии, предположительно являющиеся Campylobacter spp., пересевают на неселективный колумбийский кровяной агар и затем подтверждают при помощи исследования под микроскопом и надлежащих биохимических испытаний, и испытаний на рост. Дополнительно вид Campylobacter spp. идентифицируют путем специфических биохимических испытаний и испытаний на чувствительность к антибиотикам.

5 Питательные среды и реактивы

5.1 Общие положения

Для получения информации об общепринятой лабораторной практике см. ИСО 7218, ИСО/ТУ 11133-1 и ИСО/ТУ 11133-2.

Примечание - Ввиду наличия большого количества питательных сред и реактивов и для ясности изложения, их составы и процедуры приготовления приведены в приложении В.

5.2 Жидкая обогатительная среда: бульон Болтона

См. В.1.

5.3 Селективная среда для чашек Петри: модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (mCCD агар)

См. В.2.

5.4 Среды и реактивы для подтверждения и идентификации

5.4.1 Колумбийский кровяной агар

См. В.З.

5.4.2 Бульон для бруцелл

См. В.4.

5.4.3 Реактив для обнаружения оксидазы

См. В.5.

5.4.4 Раствор пероксида водорода, 3% (объемная доля)

5.4.5 Реактивы для определения гидролиза гиппурата

См. В.6.

5.4.6 Кровяной агар Мюллера-Хинтона

См. В.7.

5.4.7 Диски с налидиксовой кислотой и цефалотином

Каждый тип диска содержит по 30 мкг реактива.

5.4.8 Диски с индоксилацетатом

См. В.8.

6 Аппаратура

Используют обычную микробиологическую лабораторную аппаратуру (см. ИСО 7218) и, в частности, нижеприведенную.

6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав).

См. ИС0 7218.

6.2 Сушильный шкаф, ламинарный бокс или термостат, способные функционировать в диапазоне температур от 37 °С до 55 °С.

6.3 Термостат, работающий при температуре (25±1) °С, (37±1) °С и (41,5±1) °С.

6.4 Баня водяная, работающая при температуре (37±1) °С.

6.5 Баня водяная, работающая в диапазоне температур от 47 °С до 50 °С.

6.6 рН-метр, с точностью до 0,1 ед. рН при температуре 25 °С.

6.7 Емкости, в частности, культуральные пробирки с размерами 18 мм180 мм и 9 мм180 мм, пробирки для гемолиза с размерами 13 мм75 мм, бутылки с нетоксичными металлическими крышками и/или колбы подходящей вместимости с соответствующими крышками.

6.8 Чашки Петри, стеклянные или пластиковые, с диаметром 90 мм - 100 мм.

6.9 Пипетки градуированные, поставляющие полный объем, с широким отверстием, номинальной вместимостью 1 см и 10 см, градуированные с ценой деления 0,1 см, ИСО 835 класс А [1], и пастеровские пипетки, ИСО 7712 [2].

6.10 Соски резиновые, или любая другая безопасная система, которую можно адаптировать к градуированным пипеткам.

6.11 Петли стерильные, из платиново-иридиевого или никелево-хромового сплава либо пластиковые, с диаметром приблизительно 3 мм, и проволоки из того же материала или стеклянная, или пластиковая палочка.

Петля из никелево-хромового сплава не пригодна для использования в испытании на оксидазу (см.9.5.6).

6.12 Пинцет, тонкий, с закругленными краями, из нержавеющей стали.

6.13 Микроскоп предпочтительно с фазовым контрастом (для наблюдения характерной подвижности Campylobacter spp.).

6.14 Оборудование, пригодное для достижения микроаэробной атмосферы с объемными долями: кислорода (5±2)%, диоксида углерода (10±3)%, альтернативного водорода 10%, с соблюдением баланса азота. Используют надлежащие герметичные контейнеры, чтобы удерживать чашки Петри и/или колбы, или бутылки вместимостью примерно 350 см, используемые для обогатительного бульона, например, бактериологические анаэробные сосуды.

Примечание 1 - Соответствующая микроаэробная атмосфера может быть получена при использовании имеющихся в продаже газогенераторных комплектов; следует в точности соблюдать инструкции изготовителя, особенно те из них, которые касаются объема сосуда и вместимости газогенераторного комплекта. В качестве альтернативы можно использовать заполнение сосуда надлежащей газовой смесью перед инкубацией.

Примечание 2 - В качестве альтернативы инкубации в микроаэробной атмосфере, обогатительный бульон можно инкубировать в бутылках с винтовыми крышками, колбах или пробирках, заполнив их обогатительным бульоном, оставляя свободное пространство величиной менее 20 мм и тщательно закупоривая крышками.

7 Отбор проб

В лабораторию должна поступать репрезентативная проба. Она не должна подвергаться повреждению или изменению в период транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуется конкретный стандарт, распространяющийся на данную продукцию. Если не существует конкретного стандарта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия поданному вопросу.

Принимая во внимание, что Campylobacter spp. весьма чувствительны к замораживанию, но наиболее устойчивы при низких температурах, рекомендуется, чтобы пробы хранились при температуре (3±2) °С и анализировались в кратчайшие сроки. Также принимают меры по предотвращению высыхания проб.

8 Приготовление испытуемой пробы

Испытуемую пробу приготовляют в соответствии с соответствующей частью ISO 6887, распространяющейся на определенный вид продукции. Если не существует соответствующей части ISO 6887, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли согласия поданному вопросу.

9 Методика

9.1 Общие положения

См. рисунок А.1.

9.2 Проба для анализа, исходная суспензия и разбавления

9.2.1 Вводят пробу для анализа в количестве г или см (минимум 15 г или 15 см) из испытуемой пробы (раздел 8) в восьмикратный объем (120 см минимум) обогатительной среды - бульон Болтона (5.2) и гомогенизируют.

Полученная суспензия является исходной суспензией.

9.2.2 Переносят 90 см исходной суспензии (9.2.1) в бутылку вместимостью 100 см. Это соответствует 10 г пробы для анализа. При подсчете результатов это разбавление соответствует 10.

9.2.3 Переносят 10 см исходной суспензии (9.2.1) в культуральную пробирку. При подсчете результатов это разбавление соответствует 10. После следующей стадии разбавления (9.2.4) остается 9 см этого разбавления. Это соответствует 1 г пробы для анализа.

9.2.4 Делают обычную серию 10-кратных разбавлений (например, до ) из 10 разбавления (9.2.3), перенося по 1,0 см в пробирки, содержащие 9,0 см бульона Болтона. Из наибольшего разбавления отбрасывается 1,0 см, поскольку все пробирки должны содержать по 9,0 см. При подсчете результатов эти разбавления соответствуют , и т.д.

9.3 Обогащение

Инкубируют пробы для анализа и разбавления (9.2.2, 9.2.3 и 9.2.4) в микроаэробной атмосфере (6.14) при 37 °С от 4 ч до 6 ч, затем при 41,5 °С в течение (44±4) ч.

9.4 Изоляция

9.4.1 Используя каждую из культур, полученных в обогатительной среде (9.3), инокулируют стерильной петлей (6.11) поверхность слоев с селективной изолирующей средой на основе mCCD агара (5.3).

9.4.2 Инкубируют слои (9.4.1) при 41,5 °С в микроаэробной атмосфере (6.14).

9.4.3 После инкубации в течение (44±4) ч исследуют слои с целью выявления типичных и/или подозрительных колоний Campylobacter spp.

Типичные колонии на mCCD агаре имеют сероватый цвет, часто с металлическим блеском, они плоские и влажные и имеют тенденцию к разрастанию. Разрастание колоний выражено меньше на более сухих поверхностях агара. Могут встречаться и другие формы колоний.

9.5 Подтверждение вида Campylobacter spp.

9.5.1 Общие положения

Поскольку рассматриваемые бактерии быстро разрушаются на воздухе, необходимо незамедлительно следовать процедурам, описанным в 9.5.2-9.5.6.

9.5.2 Отбор колонии для подтверждения

9.5.2.1 Для подтверждения с каждого слоя (9.4.3) отбирают по меньшей мере одну колонию, рассматриваемую в качестве типичной или подозрительной колонии Campylobacter spp., исследуют морфологию и подвижность с помощью микроскопа (9.5.3.1) и продолжают тем же способом с еще четырьмя колониями, если первая дала отрицательный результат.

9.5.2.2 Производят посев каждой из отобранных колоний на слой колумбийского кровяного агара (5.4.1), чтобы дать развиться четко изолированным колониям. Слои инкубируют в микроаэробной атмосфере при 41,5 °С в течение 24 ч - 48 ч. При исследовании морфологии, подвижности, микроаэробного роста при 25 °С, аэробного роста при 41,5 °С и присутствия оксидазы используют чистые культуры.

9.5.3 Исследование морфологии и подвижности

9.5.3.1 Суспендируют одну колонию со слоя колумбийского кровяного агара (9.5.2.2) в 1 см бульона для бруцелл (5.4.2) или солевого раствора пептона и исследуют морфологию и подвижность при помощи микроскопа (6.13).

9.5.3.2 Для дальнейшего исследования сохраняют все культуры (9.5.2.2), в которых обнаружены изогнутые бациллы со спиральной "штопорообразной" подвижностью (9.5.3.1).

9.5.4 Исследование роста при температуре 25 °С (микроаэробного)

Используя колонии, изолированные в 9.5.2.2, инокулируют при помощи петли (6.11) поверхность слоя колумбийского кровяного агара (5.4.1)).

Инкубируют слой при 25 °С в микроаэробной атмосфере (6.14) в течение (44±4) ч.

Исследуют слой с целью выявления видимого роста колоний Campylobacter spp.

9.5.5 Исследование роста при температуре 41,5 °С (аэробного)

Используя колонии, изолированные в 9.5.2.2, инокулируют при помощи петли (6.11) поверхность слоя колумбийского кровяного агара (5.4.1).

Инкубируют слой при температуре 41,5 °С в аэробной атмосфере в течение (44±4) ч.

Исследуют слой с целью выявления видимого роста колоний Campylobacter spp.

9.5.6 Обнаружение оксидазы

Используя петлю из платиново-иридиевого сплава, пластиковую петлю или стеклянную палочку (6.11), отбирают порцию четко изолированной колонии из каждой отдельной чашки (9.5.2.2) и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для обнаружения оксидазы (5.4.3). Появление розовато-лилового, фиолетового или темно-синего цвета в течение 10 с свидетельствует о положительной реакции. Если используется имеющийся в продаже набор для анализа оксидазы, необходимо следовать инструкциям изготовителя.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (положительный контроль) и Escherichia coli NCTC 9001 (отрицательный контроль).

9.5.7 Интерпретация

Campylobacter spp. дает результаты согласно таблице 1.

Таблица 1 - Характеристики Campylobacter spp.

Морфология (9.5.3)

Малые искривленные бациллы

Подвижность (9.5.3)

Характерная

Микроаэробный рост при температуре 25 °С (9.5.4)

-

Аэробный рост при температуре 41,5 °С (9.5.5)

-

Оксидаза (9.5.6)

+

Campylobacter spp. присутствует, если по меньшей мере одна колония демонстрирует вышеуказанные характеристики.

9.6 Идентификация вида Campylobacter spp. (альтернативная процедура)

9.6.1 Общие положения

Из видов Campylobacter spp., произрастающих при температуре 41,5 °С, чаще всего встречаются С. jejuni и С. coli. Вместе с тем были описаны другие виды (С. lari, С. upsaliensis и некоторые другие); характеристики, приведенные в таблице 2, позволяют провести их дифференциацию.

Таблица 2 - Характеристики видов Campylobacter spp.

Характеристика

С. jejuni

С. coli

С. lari

С. upsaliensis

Каталаза (9.6.2)

+

+

+

отрицательная или в слабой форме

Налидиксовая кислота (9.6.3)

Цефалотин (9.6.3)

Гидролиз гиппурата (9.6.4)

+

-

-

-

Индоксилацетат (9.6.5)

+

+

-

+


Обозначения: +=положительная; -=отрицательная; =чувствительный; =устойчивый.


Было обнаружено увеличение устойчивости к налидиксовой кислоте штаммов С. jejuni и С. coli.

Существуют одновременно чувствительные и устойчивые штаммы С. lari.

) Существуют гиппурат-отрицательные штаммы С. jejuni.

9.6.2 Обнаружение каталазы

Для каждой колонии, отобранной в соответствии с 9.5.2.2, наносят петлю культуры в каплю раствора пероксида водорода (5.4.4) на чистом предметном стекле.

Испытание считается положительным, если в течение 30 с появляются пузырьки.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Staphylococcus aureus NCTC 8532 (положительный контроль) и Enterococcus faecalis NCTC 775 (отрицательный контроль).

9.6.3 Определение чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину

Для каждой колонии, отобранной в соответствии с 9.5.2.2, используют петлю (6.11) с целью приготовления суспензии в бульоне для бруцелл (5.4.2) плотностью 0,5 по шкале Мак Фарланда.

Разбавляют суспензию в соотношении 1:10 тем же бульоном.

Заливают суспензией поверхность слоя с 5% (объемная доля) кровяного агара Мюллера-Хинтона (5.4.6).

Выдерживают в течение 5 мин, затем сливают избыток суспензии.

Высушивают чашки в сушильном шкафу (6.2) при температуре 37 °С в течение 10 мин.

Помещают на поверхность агара диск с налидиксовой кислотой (5.4.7) и диск с цефалотином (5.4.7).

Инкубируют чашки крышками вверх при температуре 37 °С в течение (22±2) ч в микроаэробной атмосфере (6.14).

Интерпретируют результаты бактериального роста следующим образом:

- рост, который наблюдается при контакте с диском, классифицируется как устойчивый;

- при наличии зоны любых размеров, обусловленной ингибированием роста, он классифицируется как чувствительный.

9.6.4 Определение гидролиза гиппурата

Для каждой колонии, отобранной в соответствии с 9.5.2.2, используют петлю (6.11) с большим количеством инокулята с целью приготовления суспензии в пробирке для гемолиза (6.7), содержащей 0,4 см раствора гиппурата натрия (5.4.5), при этом обращают особое внимание, чтобы исключить попадание агара.

Встряхивают с целью тщательного перемешивания и инкубируют в течение 2 ч на водяной бане (6.4) при температуре 37 °С или в течение 4 ч в термостате при 37 °С.

Осторожно добавляют 0,2 см раствора нингидрина (5.4.5) на поверхность раствора гиппурата натрия. Избегают встряхивания.

Интерпретацию производят после дополнительного инкубирования в течение 10 мин на водяной бане (6.4) при 37 °С или в термостате при 37 °С.

Темно-фиолетовый цвет свидетельствует о положительной реакции.

Светло-фиолетовый цвет или отсутствие окраски свидетельствуют об отрицательной реакции.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются С. jejuni NCTC 11351 (положительный контроль), С. coli NCTC 11366 (отрицательный контроль).

9.6.5 Определение гидролиза индоксилацетата

Помещают колонию, отобранную в соответствии с 9.5.2.2, на диск с индоксилацетатом (5.4.8) и добавляют каплю стерилизованной дистиллированной воды. Для проведения отчетливой реакции требуется полная петля материала колоний.

В случае гидролиза индоксилацетата в течение 5-10 мин наблюдается изменение цвета в сторону темно-синего. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о том, что гидролиза не было.

Подтверждают результаты, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются С. jejuni NCTC 11351 (положительный контроль), С. lari NCTC 11352 (отрицательный контроль).

9.6.6 Интерпретация

Виды Campylobacter spp., показывающие рост при 41,5 °С, могут быть идентифицированы в соответствии с таблицей 2.

10 Расчет и выражение результатов

10.1 Метод расчета

Полуколичественный метод основан на количественном обнаружении в отобранных разведениях. Поэтому результат приводится в диапазонах, соответствующих таблице 3.

Таблица 3 - Диапазоны результатов для серии разбавлений

Количество, г

Рост подтвержденных Campylobacter spp.

10

-

+

+

+

+

+

+

10

-

-

+

+

+

+

+

10

-

-

-

+

+

+

+

10

-

-

-

-

+

+

+

10

-

-

-

-

-

+

+

10

-

-

-

-

-

-

+

НВЧ/г

0

0,23

2,3

23

230

2400

0

0,019

0,19

1,9

19

190

580

0,33

2,7

27

270

2700

30000

Если все испытания дали отрицательный результат, этот результат необходимо изложить как НВЧ = 0/г (верхний доверительный предел, 0,33/г); если все испытания дали положительный результат, этот результат необходимо изложить как НВЧ= (нижний доверительный предел, 580/г).

Пуассоновское распределение используется для оценки диапазона концентраций, которые согласуются с серией результатов. Например, если истинная концентрация 0,005 КОЕ/г, то вероятность положительного результата для 10 разведения составляет 5%. Если истинная концентрация 3 КОЕ/г, то вероятность положительного результата для 10 разведения составляет 95%. Однако если для 10 разведения наблюдается положительный результат, а для 10 разведения и более высоких разведений - отрицательный результат, то истинная концентрация, вероятно, находится в диапазоне между 0,005 КОЕ/г и 3 КОЕ/г.

10.2 Прецизионность

Межлабораторное совместное испытание, включающее полуколичественное определение Campylobacter spp., как описано в настоящем стандарте, было организовано в 2005 году Нордическим комитетом по анализу пищевых продуктов (NMKL). Испытание проводилось в 14 европейских лабораториях на сыром курином мясе и молоке. Каждая из проб пищевых продуктов была проанализирована при различных уровнях загрязнения плюс отрицательный контроль. Специфичность полуколичественного метода составляла 100%. Общая чувствительность метода была 82,1%. Чувствительность обнаружения Campylobacter spp. в молоке была ниже, чем в курином мясе. Количественная оценка метода для Campylobacter spp. в курином мясе, полученная в этом совместном испытании, была совместима с диапазонами концентраций, приведенными в таблице 3.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать по меньшей мере следующую информацию:

a) используемый метод отбора проб, если он известен;

b) используемый метод со ссылкой на настоящий стандарт;

c) используемая жидкая обогатительная среда;

d) используемая среда для изоляции;

e) выбранная температура инкубации;

f) полученные результаты испытаний;

g) все детали проведения испытаний, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве альтернативных, вместе с информацией о любых факторах, которые могли повлиять на результаты испытаний;

h) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы.

Приложение А
(обязательное)

Диаграмма методики


Рисунок А.1 - Диаграмма методики

Приложение В
(обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

В.1 Бульон Болтона

В.1.1 Базовая среда

В.1.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10,0 г

Гидролизат лактальбумина

5,0 г

Дрожжевой экстракт

5,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Натрия пируват

0,5 г

Натрия пиросульфит

0,5 г

Натрия карбонат

0,6 г

-Кетоглутаровая кислота

1,0 г

Гемин [растворенный в 0,1% (массовая доля) гидроксиде натрия]

0,01 г

Вода

1000 см

В.1.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде, при необходимости - путем нагрева. При необходимости корректируют рН, чтобы после стерилизации его значение для полной среды составляло 7,4±0,2 ед. рН при температуре 25 °С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на температуру 121 °С, в течение 15 мин.

В.1.2 Стерильная лизированная дефибринированная кровь лошади

Используют кровь лошади, лизированную сапонином или замораживанием и последующим размораживанием.

В.1.3 Состав антибиотического раствора

Цефоперазон

0,02 г

Ванкомицин

0,02 г

Триметоприма лактат

0,02 г

Амфотерицин В

0,01 г

Смесь этанола и воды: 1+1 частей по объему

5 см

В.1.4 Приготовление

Растворяют компоненты в смеси этанола и воды (соотношение 1:1).

В.1.5 Полная среда

В.1.5.1 Состав

Базовая среда (В.1.1)

1000 см

Стерильная лизированная дефибринированная кровь лошади (В.1.2)

50 см

Антибиотический раствор (В.1.3)

5 см

В.1.5.2 Приготовление

К базовой среде при температуре ниже 50 °С в стерильных условиях добавляют кровь, затем антибиотический раствор и перемешивают. Соблюдая стерильность, разливают среду в пробирки или колбы подходящей вместимости (см. 9.2.2), чтобы приготовить порции, необходимые для испытания. Если обогатительную среду приготовляют заранее, ее надо хранить не более 4 ч при комнатной температуре или не более 7 дней в темном месте при (3±2) °С.

В.1.6 Эксплуатационное испытание

Эксплуатационные характеристики бульона Болтона (В.1.5.1) необходимо испытывать в соответствии с методами и критериями, описанными в ИСО/ТУ 11133-2. Примерами подходящих контрольных штаммов являются C.jejuni NCTC 11351 или АТСС 33291 со следующими критериями: >10 колоний на mCCD агаре (5.3) после инкубации в микроаэробных условиях при 41,5 °С в течение (44±4) ч.

В.2 Модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (mCCD агар)

В.2.1 Базовая среда

В.2.1.1 Состав

Мясной экстракт

10,0 г

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Древесный уголь

4,0 г

Продукт ферментативного переваривания казеина

3,0 г

Дезоксихолат натрия

1,0 г

Железа (II) сульфат

0,25 г

Натрия пируват

0,25 г

Агар

8,0 г - 18,0 г

Вода

1000 см

В зависимости от прочности геля агара.

В.2.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем доведения до кипения. При необходимости корректируют рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,4±0,2 ед. рН при температуре 25 °С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на 121 °С, в течение 15 мин.

В.2.2 Антибиотический раствор

В.2.2.1 Состав

Цефоперазон

0,032 г

Амфотерицин В

0,01 г

Вода

5 см

В.2.2.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде. Стерилизуют путем фильтрации.

В.2.3 Полная среда

В.2.3.1 Состав

Базовая среда (В.2.1)

1000 см

Антибиотический раствор (В.2.2)

5 см

В.2.3.2 Приготовление

Добавляют антибиотический раствор к базовой среде, охлажденной до 47 °С - 50 °С, затем тщательно перемешивают. Разливают около 15 см полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут в темноте при температуре (3±2) °С.

В.2.4 Эксплуатационное испытание

Для определения селективности или производительности см. ИСО/ТУ 11133-1. В отношении эксплуатационных критериев см. ИСО/ТУ 11133-2:2003, таблица В.5.

В.3 Колумбийский кровяной агар

В.3.1 Базовая среда

В.3.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

23,0 г

Крахмал

1,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Агар

8,0 г - 18,0 г

Вода

1000 см

а) В зависимости от прочности геля агара.

В.3.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем нагрева. При необходимости корректируют рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2 ед. рН при температуре 25 °С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на температуру 121 °С, в течение 15 мин.

В.3.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь

В.3.3 Полная среда

В.3.3.1 Состав

Базовая среда (В.3.1)

1000 см

Стерильная дефибринированная баранья кровь (В.3.2)

50 см

В.3.3.2 Приготовление

Добавляют кровь в стерильных условиях к базовой среде, охлажденной до температуры 47 °С - 50 °С, затем перемешивают. Разливают около 15 см полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут при температуре (3±2) °С.

В.4 Бульон для бруцелл

В.4.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания казеина

10,0 г

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

10,0 г

Глюкоза

1,0 г

Дрожжевой экстракт

2,0 г

Натрия хлорид

5,0 г

Натрия гидросульфит

0,1 г

Вода

1000 см

В.4.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде, при необходимости путем нагрева. При необходимости корректируют рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,0±0,2 ед. рН при 25 °С. Разливают среду порциями по 10 см в пробирки подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на температуру 121 °С, в течение 15 мин.

В.5 Реактив для обнаружения оксидазы

В.5.1 Состав

-Тетраметил-1,4-фенилендиамина дигидрохлорид

1,0 г

Вода

100 см

В.5.2 Приготовление

Растворяют компонент в воде непосредственно перед использованием.

В.6 Реактивы для обнаружения гидролиза гиппурата

В.6.1 Раствор гиппурата натрия

В.6.1.1 Состав

Натрия гиппурат

10 г

Фосфатно-буферный солевой раствор (PBS)

Натрия хлорид

8,5 г

Динатрия гидрофосфат дигидрат ()

8,98 г

Натрия дигидрофосфат моногидрат ()

2,71 г

Вода

1000 см

В.6.1.2 Приготовление

Растворяют гиппурат натрия в растворе PBS. Стерилизуют путем фильтрации. Разливают реактив в стерильных условиях порциями по 0,4 см в небольшие пробирки подходящей вместимости (6.7). Хранят при температуре примерно 20 °С.

В.6.2 Раствор нингидрина, 3,5% (масса на объем)

В.6.2.1 Состав

Нингидрин

1,75 г

Ацетон

25 см

Бутанол

25 см

В.6.2.2 Приготовление

Растворяют нингидрин в смеси ацетона и бутанола. Хранят раствор в холодильнике в темноте максимально в течение одной недели.

В.7 Кровяной агар Мюллера-Хинтона

В.7.1 Базовая среда

В.7.1.1 Состав

Продукт ферментативного переваривания животных тканей

6,0 г

Продукт ферментативного переваривания казеина

17,5 г

Крахмал, растворимый

1,5 г

Агар

8,0 г - 18,0 г

Вода

1000 см

В зависимости от прочности геля агара.

В.7.1.2 Приготовление

Растворяют базовые компоненты или полную обезвоженную базовую среду в воде путем доведения до кипения. При необходимости корректируют рН, чтобы после стерилизации его значение составляло 7,3±0,2 ед. рН при температуре 25 °С. Разливают базовую среду в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на температуру 121 °С, в течение 15 мин.

В.7.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь

В.7.3 Полная среда

В.7.3.1 Состав

Базовая среда (В.7.1)

1000 см

Стерильная дефибринированная баранья кровь (В.7.2)

50 см

В.7.3.2 Приготовление

Добавляют кровь в стерильных условиях к базовой среде, охлажденной до температуры 47 °С - 50 °С, затем перемешивают. Разливают около 15 см полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более 7 сут при температуре (3±2) °С.

В.8 Диски с индоксилацетатом

В.8.1 Состав

Индоксилацетат

0,1 г

Ацетон

1 см

В.8.2 Приготовление

Растворяют индоксилацетат в ацетоне. Наносят от 25 мкл до 50 мкл этого раствора на чистые бумажные диски (диаметром от 6 мм до 12 мм). После высушивания при комнатной температуре хранят диски при температуре (3±2) °С в коричневых пробирках или бутылках в присутствии силикагеля.

Приложение ДА
(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов и документов ссылочным национальным стандартам Российской Федерации (и действующим в этом качестве межгосударственным стандартам)

Таблица ДА.1

Обозначение ссылочного международного стандарта, документа

Степень соответствия

Обозначение и наименование соответствующего национального стандарта

ИСО 6887

-

*

ИСО 7218:2007

IDT

ГОСТ ISO 7218-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям"

ИСО/ТУ 11133-1:2009

IDT

ГОСТ ISO 11133-1-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории"

ИСО/ТУ 11133-2:2003

IDT

ГОСТ ISO 11133-2-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред"

* Соответствующий национальный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов.

Примечание - В настоящей таблице использовано условное обозначение степени соответствия стандартов:

- IDT - идентичные стандарты.

Библиография

[1]

ISO 835 Посуда лабораторная стеклянная. Мерные градуированные пипетки

[2]

ISO 7712 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки Пастера одноразового применения

[3]

NKML Method No. 119, Thermotolerant Campylobacter - Detection, semi-quantitative and quantitative determination in foods and drinkinq water. Available (2009-06-09) from: http://shop.nmkl.org/

[4]

Baylis, C.L., MacPhee, S., Martin, K.W., Humphrey, T.J., Betts, R.P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. from foods. J. Appl. Microbiol. 2000, 89, pp. 884-891

[5]

Bolton, F.J., Hutchinson, D.N., Coates, D. Blood-free selective medium for isolation of Campylobacter jejuni from feces. J. Clin. Microbiol. 1984, 19, pp. 169-171

[6]

Bolton, F.J., Sails, A.D., Fox, A.J., Wareing, D.R., Greenway, D.L. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay. J. Food Prot. 2002, 65, pp. 760-767

[7]

Corry, J.E.L., Curtis, G.D.W., Baird, R.M., editors. Handbook of culture media for food microbiology. Elsevier, Amsterdam, 2003 (Progress in industrial microbiology, Vol. 37)

[8]

Hutchinson, D.N., Bolton, F.J. Improved blood free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimens. J. Clin. Pathol. 1984, 37, pp. 956-957

[9]

Josefsen, M.H., , P.S., Aalbaek, В., Hoorfar, J. Preston and Park-Sanders protocols adapted for semi-quantitative isolation of thermotolerant Campylobacter from chicken rinse. Int. J. Food Microbiol. 2003, 80, pp. 177-183

[10]

Rosenquist, H., Bengtsson, A., Hansen, T.B. A collaborative study on a Nordic standard protocol for detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter in food (NMKL119, 3. Ed., 2007). Int. J. Food Microbiol. 2007,118, pp. 201-213

Электронный текст документа

и сверен по:

, 2013