ГОСТ Р 71327-2024
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАЧЕСТВО ВОДЫ
Методы определения санитарно-микробиологических и санитарно-паразитологических показателей при оценке воды поверхностных водных объектов и сточных вод
Water quality. Methods for determining sanitary-microbiological and sanitary-parasitological indicators for assessing water in surface water bodies and wastewater
ОКС 13.060.70
Дата введения 2024-05-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Российской ассоциацией водоснабжения и водоотведения (РАВВ) совместно с Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды", Федеральным государственным бюджетным учреждением "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина" (ФГБУ "ЦСП" ФМБА России), Федеральным бюджетным учреждением науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН РостовНИИМП Роспотребнадзора), Федеральным бюджетным учреждением науки "Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН "ФНЦГ им.Ф.Ф.Эрисмана" Роспотребнадзора)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 343 "Качество воды"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 4 апреля 2024 г. № 413-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. № 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.rst.gov.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на поверхностные воды, воды поверхностных водоисточников, используемых для централизованного водоснабжения населения, воды водоисточников хозяйственно-бытового и рекреационного водопользования, воды поверхностных пресноводных и морских водоемов в местах водозаборов и в зонах рекреации в черте населенных пунктов, и на другие типы поверхностных вод, сточные воды, в том числе сточные, поступающие на очистные сооружения, сточные воды, допустимые к сбросу в поверхностные водные объекты вне черты населенных мест, на сточные воды, допустимые к сбросу в поверхностные водные объекты, на сточные воды, допустимые к сбросу в объекты рыбохозяйственного значения и на иные, а также на технические воды открытой и закрытой системы водоснабжения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4159 Реактивы. Йод. Технические условия
ГОСТ 4232 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия
ГОСТ 4233 Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6824 Глицерин дистиллированный. Технические условия
ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 17299 Спирт этиловый технический. Технические условия
ГОСТ 23519 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 23932 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
ГОСТ 24849 Вода. Методы санитарно-бактериологического анализа для полевых условий
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 30813 Вода и водоподготовка. Термины и определения
ГОСТ 31942 (ISO 19458:2006) Вода. Отбор проб для микробиологического анализа
ГОСТ 31955.1 (ISO 9308-1:2000) Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации
ГОСТ 32010 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Shigella
ГОСТ 34786 Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков
ГОСТ ISO 7899-2 Качество воды. Обнаружение и подсчет кишечных энтерококков. Часть 2. Метод мембранной фильтрации
ГОСТ ISO 15553 Качество воды. Выделение из воды и идентификация ооцист криптоспоридий и цист лямблий
ГОСТ ISO 16266 Качество воды. Обнаружение и подсчет Pseudomonas aeruginosa. Метод мембранной фильтрации
ГОСТ ISO 20838-2014 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция для обнаружения патогенных пищевых микроорганизмов. Требования к амплификации и обнаружению для качественного анализа
ГОСТ ISO 21570-2009 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте
ГОСТ ISO/TS 13136-2016 Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145
ГОСТ Р 59024-2020 Вода. Общие требования к отбору проб
ГОСТ Р 51232 Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества
ГОСТ Р 54502/ISO/TS 19036:2006 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководство по оценке неопределенности измерений при количественных определениях
ГОСТ Р 70151-2022 Качество воды. Отбор проб для проведения паразитологических исследований
ГОСТ Р 70152-2022 Качество воды. Методы внутреннего лабораторного контроля качества проведения микробиологических и паразитологических исследований
ГОСТ Р ИСО 21748 Статистические методы. Руководство по использованию оценок повторяемости, воспроизводимости и правильности при оценке неопределенности измерений
ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 30813, ГОСТ 34786, ГОСТ Р 70151, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 сточные воды: Воды, отводимые после использования в хозяйственно-бытовой и производственной деятельности человека, включая поверхностный сток с территорий поселений и объектов производственной деятельности.
3.2 поверхностные воды: Постоянное или временное сосредоточение вод на поверхности суши в формах ее рельефа, имеющее: границы, объем и черты водного режима [моря или их отдельные части (проливы, заливы, в т.ч. бухты, лиманы и др.); водотоки (реки, ручьи, каналы); водоемы (озера, пруды, обводненные карьеры, водохранилища); болота; природные выходы подземных вод (родники, гейзеры): ледники, снежники].
3.3 обобщенные колиформные бактерии: Грамотрицательные, оксидазоотрицательные, лактозоположительные и лактозоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре (37±1)°C, в течение 24 ч.
3.4 общие колиформные бактерии: Оксидазоотрицательные, грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре (37±1)°C в течение (24±2) ч и до 48 ч при отсутствии газа.
3.5 колифаги: Бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса (бляшки) через (18±2) ч при температуре (37±1)°C на ее газоне на питательном агаре.
3.6 криптоспоридии (лат. Cryptosporidium): Род простейших одноклеточных организмов, паразитирующих в тонком кишечнике и дыхательных путях человека, других млекопитающих и птиц и вызывающих заболевание криптоспоридиоз.
3.8 гельминты: Общее наименование паразитических червей, обитающих на разных стадиях жизненного цикла в организме человека, животных и растений, вызывая гельминтозы.
4 Сокращения
В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
АТМ - аналитические трековые мембраны;
БОЕ - количество бляшкообразующих единиц;
ДСН - дуплекс-специфическая нуклеаза;
ИМС - иммуномагнитная сепарация;
КОЕ - колонии образующие единицы;
МИС - молочно-ингибиторная среда;
НВЧ - наиболее вероятное число;
ПВА - поливинилацетат;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ТТХ - трифенилтетразолий хлорид;
ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид;
ЭКД - экстракт кормовых дрожжей.
5 Оборудование, расходные материалы, стандартные образцы
5.1 Для реализации методов проведения санитарно-микробиологических исследований/испытаний используют следующую аппаратуру:
- стерилизатор паровой;
- стерилизатор суховоздушный;
- горелки газовые или спиртовки по ГОСТ 25336;
- термостат, обеспечивающий поддержание температуры (37±1)°C;
- термостат, обеспечивающий поддержание температуры (44,0±0,5)°C;
- термостат, обеспечивающий поддержание температуры (42±1)°C;
- pH-метр, обеспечивающий измерение водородного показателя pH с допускаемой точностью ±0,1;
- холодильник, обеспечивающий температуру плюс (6,0±2)°C;
- аппарат для мембранной фильтрации под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 35 или 47 мм.
Примечание - Допускается использовать одноразовые стерильные фильтровальные аппараты;
- устройство электрическое или ручное для создания разрежения или насос водоструйный;
- емкости из нержавеющей стали или эмалированные с крышкой для стерилизации мембранных фильтров методом кипячения;
- фильтры мембранные из эфиров целлюлозы (нитрата или ацетата целлюлозы) или их смеси, трековые мембраны диаметром от 35 до 47 мм, номинальным диаметром пор 0,45 мкм, стерильные от производителя или простерилизованные и упакованные в лаборатории;
- пипетки стеклянные вместимостью 1,0; 5,0; 10,0 мл с ценой деления 0,1 мл многоразового использования по ГОСТ 29227 или пластиковые одноразового использования;
- пробирки лабораторные многоразового или одноразового использования;
- посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770: цилиндры вместимостью от 100 до 2000 мл;
- чашки бактериологические (Петри) стеклянные по ГОСТ 23932 или пластмассовые однократного применения, диаметром 60 и 90 мм;
- петли бактериологические одноразового или многоразового применения;
- пробки силиконовые, выдерживающие стерилизацию сухим жаром;
- стандарт мутности оптический бактериальных взвесей 10МЕ;
- средства защиты (очки, резиновые перчатки, халаты, бахилы, шапочки, маски);
- бокс биологической безопасности не ниже II класса (типа А или Б);
- дозатор механический одноканальный не более 200; 1000 мкл;
- наконечники для механического дозатора 200, 1000 мкл;
- весы с разрешающей способностью не более 1% для обеспечения максимальной допустимой погрешности 5% по массе.
Примеры
1 Для взвешивания 10 г вещества весы должны обеспечить считывание до 0,1 г.
2 Для взвешивания 1 г вещества весы должны обеспечить считывание до 0,01 г.
_______________
5.2 Для проведения санитарно-паразитологических исследований/испытаний применяют аппаратуру, включая средства измерения, реактивы, расходные материалы, посуду по ГОСТ Р 70151-2022 (раздел 4), включая нижеприведенные:
5.2.3 Микроскопы флуоресцентные (люминесцентные) с УФ-фильтром (длина волны возбуждения - 350 нм; длина волны эмиссии - 450 нм), фильтром FITC (длина волны возбуждения - 480 нм; длина волны эмиссии - 520 нм) или флуоресцентная насадка к микроскопу, например "ОптиЛюм", или аналогичные.
5.2.4 Фильтры мембранные для санитарно-паразитологических исследований на основе ацетатов целлюлозы типа: МФАС-СПА размерами пор от 1,5 до 3,0 мкм; МФАС-П-4 размерами пор от 2,4 до 4,5 мкм или прозрачные аналитические трековые мембраны АТМ на основе полиэтилентерефталата размерами пор от 2,5 до 4,0 мкм. Основной рекомендуемый диаметр фильтровальных дисков для исследования, применяемых в паразитологических лабораториях 142 мм, в зависимости от диаметра фритты фильтродержателя используемого фильтровального оборудования. Уплотнительные кольца в комплекте фильтров АТМ.
5.2.5 Предфильтры - капроновая сетка с ячейками 25 мкм, от 60 до 70 мкм.
5.2.7 Посуда лабораторная стеклянная или пластиковая одноразового использования (химические стаканы, колбы, чашки Петри, цилиндры измерительные, ковши градуированные, пробирки центрифужные градуированные):
- воронки конические стеклянные разных объемов;
- пипетки стеклянные или одноразовые (типа Пастера);
- кюветы из нержавеющей стали;
- горелка газовая или спиртовки;
- штативы лабораторные для пробирок и микропробирок;
- пластинки (диски) тонкие пластмассовые квадратные или круглые для переноса мембраны на лоток собственного или заводского изготовления;
- слайды типа SuperStick (предметные стекла): S100-1 (одно окно), S100-2 (два окна), S100-3 (три окна);
- флюорокраситель Стейн - 0,1%-ный водный раствор калькофлюора белого;
- наборы готовые по Циль-Нильсену;
- ячейка влажности;
- термостат, поддерживающий рабочую температуру 37°C и обеспечивающий градиент температуры в камере минус 1°C;
- штатив наклонный для слайдов;
- наконечники для автоматических пипеток;
- вортекс лабораторный;
- ротатор лабораторный;
- таймер лабораторный;
- штативы лабораторные для пробирок и микропробирок;
- штатив для микроцентрифужных пробирок;
- бальзам канадский (лак бесцветный);
- дозаторы пипеточные полуавтоматические с наконечниками.
5.2.8 Инструментарий металлический: пинцеты для работы с мембранными фильтрами.
Оборудование, необходимое для экстракции нуклеиновых кислот, описано в ГОСТ Р ИСО 21571-2014 (пункт А.3.1.6).
Для реализации метода с использованием ПЦР (и флуоресцентной детекции) помимо иного лабораторного оборудования необходимо оборудование, приведенное в ГОСТ ISO 20838-2014 (раздел 6); при флуоресцентной детекции результатов ПЦР применяют амплификатор с возможностью такой детекции (работе в режиме реального времени).
Оборудование для проведения электрофореза описано в ГОСТ ISO/TS 13136-2016 (пункт С.3.5).
Кисти жесткие (из щетины) и мягкие (из волоса белки, колонка или соболя) для живописи № 12 - № 18.
Реактив Ковача коммерческий.
3%-ная перекись водорода.
3%-ный раствор КОН.
Реактивы или коммерческие наборы для определения цитохромоксидазы.
Реагенты, материалы расходные и реактивы химические диагностического набора для реализации метода иммуномагнитной сепарации в соответствии с инструкцией производителя.
Реагенты для экстракции нуклеиновых кислот описаны в ГОСТ Р ИСО 21571-2014 (пункты А.3.1.5.2-А.3.5.12, А.3.1.5.14-А.3.1.5.20, А.4.1.5, А.5.1.5).
Реагенты и расходные материалы для проведения ПЦР описаны в ГОСТ ИСО 21570-2009 (пункт А.1.5), за исключением того, что олигонуклеотиды должны соответствовать указанным в разделе 14 параметрам, и ГОСТ ISO 20838-2014 (раздел 5). Пробирки для проведения реакции должны соответствовать используемой модели амплификатора.
Реагенты и расходные материалы для электрофореза описаны в ГОСТ ISO/TS 13136-2016 (пункты С.3.5.12-С.3.5.14 и С.3.6.2-С.3.6.9).
Примечание - Допускается применение реагентов, реактивов, приготовленных согласно приведенной в настоящем стандарте рецептуре и расходных материалов, тест-систем и тест-наборов промышленного производства с аналогичными характеристиками, а также готовых реактивов и наборов промышленного производства, зарегистрированных и разрешенных к использованию в установленном порядке.
6 Приготовление и контроль питательных сред [1]
Для определения показателей микробиологического загрязнения воды при воспроизведении методов, указанных в настоящем стандарте используют следующие питательные среды: среда Эндо; полужидкая или жидкая с поплавком среда Гисса с глюкозой, полужидкая или жидкая с поплавком среда Гисса с лактозой, среда Эйкмана с глюкозой, среда Эйкмана с лактозой, лактозо-пептонная среда с борной кислотой, бульон Макконки, среда Кесслера, среда с Тергитолом 7 (лактозная среда с ТТХ и гептадецилсульфатом натрия), висмут-сульфит агар, среда Бонде; триптофановый бульон (среда 15), среда № 9 (Кинг А), цетримидный агар, азидная среда Сланец-Бартли, энтерококкагар, желчно-эскулин-азидная среда, селенитовый бульон, селенит-цистиновый бульон, щелочно-полимиксиновая среда, среда Раппапорта-Вассилиадиса, среда Мюллера-Кауфмана, хромогенные среды для определения колиформ, энтерококков и сальмонелл, ксилозо-лизин-дезоксихолатный (XLD) агар, XLT-4 агар, SS-агар, дезоксихолатный цитратный агар (Гинса), агар Плоскирева, висмут-сульфит агар, среды Олькеницкого, Клиглера и Ресселя, мясо-пептонный агар, цетримидный агар, и другие среды, разрешенные к применению в установленном порядке.
Примечания
1 Допускается для повышения дифференцирующих свойств среды Эндо в готовую и охлажденную до температуры от 60°C до 70°C среду перед разливкой в чашки добавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5%-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина - не более 1 мес.
2 Допускается в тех случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина добавлять на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты - не более 1 мес.
Допускается применение питательных сред, приготовленных согласно рецептуре и приведенных в ГОСТ 34786, ГОСТ 31955.1, ГОСТ 24849, а также применение коммерческих сухих и готовых питательных сред промышленного производства, зарегистрированных и разрешенных к использованию в установленном порядке.
При использовании коммерческих готовых или сухих питательных сред следует соблюдать способ приготовления, применения и сроки хранения, указанные изготовителем.
В качестве контрольных (эталонных) штаммов для проверки ростовых свойств и качества питательных сред используют тест-штаммы с типичными биохимическими свойствами из официально признанных коллекций микроорганизмов, отличающиеся генетической стабильностью и изученными фенотипическими характеристиками, в том числе чувствительностью к антибактериальным препаратам. В условиях лаборатории штаммы должны сопровождаться паспортом и храниться в соответствии с действующими санитарными правилами таким образом, чтобы возможность мутаций и контаминации культур была минимальной.
7 Общие требования к отбору, транспортированию, хранению проб
Санитарно-микробиологические и паразитологические исследования должны быть проведены в соответствии с требованиями санитарного законодательства по организации безопасности выполнения работ с патогенными биологическими агентами [2]. Отбор проб проводят специалисты, прошедшие обучение на рабочем месте, которое включает ознакомление с инструкцией по отбору проб и практические занятия по отбору проб конкретных типов вод в соответствии с ГОСТ Р 59024-2020 (4.7).
7.1 Отбор проб на санитарно-микробиологические виды исследования
Посуда, применяемая для микробиологического исследования (пробирки, колбы, флаконы, чашки), в том числе для отбора проб, должна проходить соответствующую подготовку по ГОСТ Р 70152-2022 (6.1). Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую или многократного применения (предварительно обеззараженную) посуду с притертыми или завинчивающимися крышками. Посуда (емкости) для многократного использования должна быть изготовлена из материалов, выдерживающих обработку дезинфицирующими средствами.
Отбор и хранение проб проводят в соответствии с ГОСТ 31942 со следующими дополнениями:
- пробы сточной воды, допустимой к сбросу в поверхностные водные объекты, отбирают с соблюдением правил асептики в стерильную посуду стерильными средствами в специализированной одежде (в перчатках, масках, халатах или костюмах), обеспечивающей безопасность пробоотборщика. Допускается использовать любые устройства для отбора поверхностных и глубинных проб, за исключением тех приспособлений, которые не пригодны для стерилизации или фламбирования;
- при наличии плавучих средств (корабля, лодки, судна и т.п.) отбор проб проводят в середине водотока с подветренного борта, со стоящего на якоре плавучего средства - с носа;
- при отборе нескольких проб одним пробоотборным устройством (батометром) его каждый раз стерилизуют фламбированием;
- любые возможности загрязнения стерильных устройств для отбора проб за счет средств крепления (веревки, канаты, тросы) должны быть сведены к минимуму, например, при использовании проволоки из нержавеющей стали или цепочки на нижнем конце троса. После наполнения стерильные емкости закрывают пробкой и стерильным колпачком;
- при необходимости установления влияния глубоководного выпуска сточных вод на зону водопользования следует отбирать пробы с учетом того течения, которое определяют по направлению движения поплавка от места выпуска сточных вод.
Транспортировать пробы следует в сумках-холодильниках или в ящиках с термоизолирующей прокладкой при температуре от 4°C до 8°C, предохраняя от резких толчков, замерзания, действия солнечных лучей в течение 6 ч с момента отбора пробы. Если не представляется возможным создать условия транспортирования с охлаждением, то анализ проб следует провести в течение 2 ч после отбора.
7.2 Отбор проб на санитарно-паразитологические виды исследований
Отбор проб при проведении исследований данного вида выполняют в соответствии с ГОСТ Р 70151-2022 (5.7, 5.8, 5.9).
7.2.1 Отбор проб поверхностных и сточных вод с помощью фильтровальных приборов в полевых условиях непосредственно в точке забора
8 Методы посева
Надлежащие условия проведения микробиологических и паразитологических исследований должны быть обеспечены проведением внутреннего лабораторного контроля в соответствии с ГОСТ Р 70152.
Для определения санитарно-микробиологических показателей в пробах поверхностных и сточных вод используют нижеприведенные методы исследований.
Перед посевом пробу тщательно перемешивают (стараясь не намочить пробку), край емкости фламбируют открытым пламенем, пробирки и чашки, подготовленные для посева, маркируют.
Посев осуществляют методом прямого поверхностного посева на агаризованные среды по 8.1, методом мембранной фильтрации по 8.2 и титрационным методом по 8.3. Рекомендуемые объемы для посева всех перечисленных санитарно-микробиологических показателей в зависимости от типа исследуемой воды представлены в приложении А.
8.1 Метод прямого поверхностного посева на агаризованные среды
При неизвестном уровне загрязнения исследуемой пробы следует использовать метод децимальных разведений. Разведения исследуемого образца пробы готовят непосредственно перед анализом в соответствии с ГОСТ Р 70152-2022 (12.1, 12.2).
Процедуру приготовления разведений продолжают по описанной схеме до получения суспензии с необходимой концентрацией исходного образца.
8.2 Метод мембранной фильтрации
8.2.1 Подготовка аппарата для фильтрования и фильтрация
Перед началом исследований фильтровальный аппарат и воронку смачивают 96%-ным спиртом и фламбируют. После охлаждения воронку снимают, а на фритту кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, поверх которого закрепляют воронку фильтровальной установки.
В воронку для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают разрежение и отфильтровывают содержимое воронки.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, добиваясь отсутствия пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
На одну чашку допускается помещать от двух до четырех фильтров (в зависимости от диаметра фильтров и чашки Петри) с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева.
Оптимальным является использование фильтров диаметром 35 и 47 мм и чашек Петри диаметром 60 и 90 мм.
При посеве нескольких объемов из одной пробы воды фильтрование проводят через один аппарат для фильтрования без фламбирования. Вначале фильтруют меньшие, а затем большие объемы воды, используя для каждого объема отдельный фильтр.
8.2.2 Подготовка мембранных фильтров
Подготовку мембранных фильтров проводят в соответствии с рекомендациями производителя.
Проверяют мембранные фильтры в соответствии с ГОСТ Р 70152-2022 (5.12).
Рекомендуемые схемы посева воды из различных объектов при работе методом мембранной фильтрации приведены в приложении А.
8.3 Титрационный метод
Метод основан на посеве нескольких децимальных разбавлений пробы, в двух- или трехкратной повторности каждого разбавления, в жидкую среду обогащения, с последующим высевом из пробирок, где был отмечен положительный рост, на плотные дифференциальные среды. При необходимости выполняют дальнейшую идентификацию. Расчет результата проводят статистически по совокупности положительных посевов в жидкой среде по специальным таблицам НВЧ (наиболее вероятного числа), приведенным в приложении Б.
Рекомендуемые объемы для посева в зависимости от типа исследуемой воды представлены в приложении А.
Титрационный метод может быть использован:
- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения исследования методом мембранной фильтрации;
- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
- в случае высокого бактериального загрязнения воды, препятствующего получению на фильтрах изолированных колоний.
Рекомендуемая схема посева воды из различных объектов при работе титрационным методом приведена в приложении А. Посев проводят в двух-трех параллельных рядах, учитывая при этом, что чем больше повторностей, тем выше точность получаемых результатов (см. приложение Б).
Использованные пипетки и наконечники погружают в рабочий раствор дезинфицирующего средства. Через требуемое время экспозиции согласно инструкции применяемого средства после обеззараживания многоразовые пипетки тщательно промывают проточной водопроводной водой, после чего промывают дистиллированной водой и высушивают.
После окончания исследования использованную лабораторную посуду с отработанным материалом обеззараживают.
После обеззараживания лабораторную посуду многократного применения моют с использованием соответствующих средств, не содержащих фосфаты, после чего тщательно промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.
9 Методы определения санитарно-микробиологических показателей
9.1 Определение обобщенных колиформных бактерий в воде методом мембранной фильтрации [3]
В индикаторную группу обобщенных колиформных бактерий входят помимо общих колиформных бактерий еще и лактозоотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие глюкозу до кислоты и газа при температуре (37±1)°C, в течение 24 ч.
Определение обобщенных колиформных бактерий выполняют на среде Эндо.
Примечание - При исследовании проб, содержащих большое количество посторонней микрофлоры, допускается использовать среду Эндо с селективными добавками в соответствии с примечаниями, приведенными в разделе 6.
Если на фильтрах выросли темно-красные, красные, с металлическим блеском или без него, с отпечатком на среде или без него, розовые, бордовые, а также бесцветные колонии, бесцветные колонии с розовым или красным центром, характерных для обобщенных колиформных бактерий выполняют оксидазный тест и делают окраску по Граму в соответствии с приложением В. Подсчитывают число колоний каждого типа, не изменивших цвет (оксидазоотрицательных), проводят пересев в полужидкие/жидкие среды Гисса с глюкозой. Исследуют не менее двух-трех колоний каждого типа. Инкубируют посевы при температуре (37±1)°C в течение 24 ч. Первичный учет возможен через 4 ч от момента посева. Учитывают в сумме те колонии, которые способны ферментировать глюкозу и образовывать кислоту и газ. При признаках проявления реакции, но не позднее чем 5 мин фильтр переносят обратно на среду Эндо и учитывают результат после четкого проявления реакции.
Допускается для соблюдения чистоты культуры перед пересевом в полужидкие/жидкие среды с глюкозой по две-три отобранные для идентификации колонии каждого морфологического типа рассеять методом истощающего штриха на сектора чашки со средой Эндо с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч. После оценки чистоты культуры выполняют тест на наличие цитохромоксидазы (см. В.3), а также выполняют окраску по Граму (см. В.4) или тест Грегерсена (см. В.5). Грамотрицательные, оксидазоотрицательные колонии пересевают в пробирки с жидкой или полужидкой средой Гисса с глюкозой. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч. Предварительный учет сбраживания глюкозы можно проводить через 4-5 ч от момента посева.
Изменение цвета среды и наличие признаков газообразования свидетельствуют о положительном результате.
Учету не подлежат пленчатые, губчатые колонии, с неровной поверхностью и краями, плесневые и другие колонии, не характерные для обобщенных колиформных бактерий.
Обобщенные колиформные бактерии можно определять также на хромогенных средах без дальнейшей идентификации бактерий.
В случае обнаружения оксидазаотрицательных, грамотрицательных, лактозоотрицательных розовых, бесцветных или бесцветных колоний с розовым или красным центром, ферментирующих глюкозу только до кислоты или до кислоты и газа, рекомендуется проверить их на принадлежность к патогенным бактериям рода Salmonella и Shigella.
Если все колонии оксидазоположительные или грамположительные, дают отрицательный ответ.
При необходимости посев на среде Эндо для определения обобщенных колиформных бактерии можно использовать для определения показателя E.coli.
Определение обобщенных колиформных бактерий может быть выполнено с применением сред на подложке (например, Петри-тесты или аналогичные) или метода время пролетной масс-спектрометрии с матрично ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) или с использованием автоматического бактериологического анализаторов в соответствии с инструкцией производителя.
Учет и выдачу результатов проводят согласно 9.4.
9.2 Определение общих колиформных бактерий в воде методом мембранной фильтрации
Определение общих колиформных бактерий выполняют на среде Эндо.
Примечание - При исследовании проб, содержащих большое количество посторонней микрофлоры, допускается использовать среду Эндо с селективными добавками в соответствии с примечаниями, приведенными в разделе 6.
Общие колиформные бактерии можно определять также на среде Тергитол-7, хромогенных или других аналогичных средах, разрешенных к применению в установленном порядке.
Учету на среде Эндо подлежат колонии типичные бордовые, темно-красные, красные, с металлическим блеском или без него, с отпечатком на обратной стороне фильтра и на среде. Выполняют оксидазный тест и тест на грам-принадлежность в соответствии с приложением В. Подсчитывают число оксидазоотрицательных, грамотрицательных колоний и производят их пересев в полужидкие/жидкие среды с лактозой. Исследуют не менее двух-трех колоний каждого типа. Инкубируют посевы при температуре (37±1)°C в течение 44-48 ч. Первичный учет возможен через 24 ч. Суммируют колонии, которые способны ферментировать лактозу и образовывать кислоту и газ.
Учету не подлежат бесцветные, пленчатые, губчатые колонии, с неровной поверхностью и краями, плесневые и другие колонии, не характерные для общих колиформных бактерий.
Допускается перед началом постановки всех тестов для оценки чистоты культуры по две-три отобранные для идентификации колонии рассевать до отдельных колоний методом истощающего штриха на сектора чашки со средой Эндо и в пробирку или на чашку с питательным агаром с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч. После оценки чистоты культуры на среде Эндо выполняют тест с культурой на питательном агаре на наличие цитохромоксидазы (см. В.3), а также выполняют окраску по Граму (см. В.4) или тест Грегерсена (см. В.5). Грамотрицательные, оксидазоотрицательные колонии пересевают в пробирки с жидкой или полужидкой средой Гисса с лактозой. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37±1)°C в течение 44-48 ч. Изменение цвета среды и наличие признаков газообразования свидетельствуют о положительном результате. Первичный учет возможен через 24 ч.
Все оксидазо- и грамотрицательные колонии, утилизирующие лактозу при температуре (37±1)°C в течение 44-48 ч до кислоты и газа, относятся к общим колиформным бактериям.
Определение общих колиформных бактерий может быть выполнено с применением сред на подложке (например, Петри-тесты или аналогичные) или метода время пролетной масс-спектрометрии с матрично ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) или с использованием автоматического бактериологического анализаторов в соответствии с инструкцией производителя.
Учет и выдачу результатов проводят согласно 9.4.
9.3 Определение E.coli в воде методом мембранной фильтрации
Определение E.coli выполняют на одной из селективных дифференцирующих лактозных средах (например, Эндо, Тергитол-7) или на хромогенных средах.
Мембранный фильтр помещают на одну из выбранных сред и инкубируют посевы при температуре (37±1)°C в течение (21±3) ч. При использовании среды Тергитол-7 для повышения селективных свойств среды инкубирование можно осуществлять при температуре (44±0,5)°C в течение 18-24 ч.
На среде Эндо учету подлежат характерные темно-красные колонии с металлическим блеском или без него, с отпечатком на среде под фильтром. На среде Тергитол-7 подсчитывают колонии с желто-оранжевой, кирпично-красной окраской, иногда с ржаво-окрашенным центром, образующие желтый отпечаток на среде под мембраной.
Отбирают по две-три колонии каждого морфологического типа, проводят их дальнейшее подтверждение на принадлежность к бактериям E.coli. Определяют наличие цитохромоксидазы и грампринадлежности (см. приложение В). Оксидазо- и грамотрицательные колонии пересевают в триптофановый бульон (среда № 15) и полужидкую среду Гисса с лактозой или лактозо-пептонную среду с борной кислотой с поплавком, инкубируют в термостате при температуре (44±0,5)°C в течение 18-24 ч. После инкубации в пробирки стриптофановым бульоном добавляют две-три капли реактива Ковача для определения индола.
Допускается перед началом постановки всех тестов для оценки чистоты культуры отобранные для идентификации колонии рассеивать до отдельных колоний методом истощающего штриха на сектора чашки со средой Эндо и в пробирку или на чашку с питательным агаром с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч. После оценки чистоты культуры на среде Эндо или на питательном агаре выполняют тест на наличие цитохромоксидазы (см. В.3), окраску по Граму (см. В.4) или тест Грегерсена (см. Г.1) и другие подтверждающие тесты.
При использовании хромогенных сред цвет колоний E.coli будет соответствовать описанию производителя среды. Например, на среде Chromocult Coliformen Agar колонии E.coli будут фиолетового цвета, на среде HiChrome Coliform agar колонии E.coli будут бирюзового цвета.
При необходимости определение индола на хромогенных средах большинства производителей можно выполнять путем накалывания реактива Ковача непосредственно на колонию. Исключением являются среды усиленной формулы, ингибирующие аэромонады, такие как Chromocult Coliformen agar ES. На таких средах определение индола следует выполнять традиционным способом на средах с триптофаном.
Определение E.coli может быть выполнено с применением сред на подложке (например, Петри-тесты или аналогичные) или метода время пролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) или с использованием автоматического бактериологического анализатора в соответствии с инструкцией производителя.
Учет и выдачу результатов проводят согласно 9.4.
9.4 Учет результатов
В случаях исследования нормируемого объема и при отсутствии роста во всех посевах результат представляется как "не обнаружены в нормируемом объеме".
Когда в двух последовательных разведениях (при наличии серии разведений) получены значения, доступные для подсчета, вычисление результата проводят по формуле расчета средневзвешенной величины
где C - количество КОЕ в объеме, регламентируемом нормативными документами для выдачи протокола;
Z - суммарное количество колоний, просчитанное в посевах во всех исследованных объемах, подлежащих учету;
9.4.1 Округление результата
Когда исследован весь нормируемый объем, результат представляется фактически полученной цифрой. При получении цифрового значения менее 1 результат округляется до первого знака после запятой.
При учете нескольких посеянных объемов и при вычислении среднего значения или исследовании объемов, меньше нормированных и при необходимости выполнения пересчета на определенную нормативным документом единицу измерения полученный результат округляют до второй значащей цифры. Если третье число менее 5, его заменяют нулем. Если последняя цифра равна или более 5, то ее заменяют нулем, а предшествующую цифру увеличивают на единицу.
9.4.2 Вычисление результата при проведении идентификации
При наличии колоний разного морфологического типа выполняют их идентификацию согласно используемой методике. После идентификации рассчитывают отдельно по каждому типу колоний количество целевых микроорганизмов из их общего числа на чашке по формуле
где a - рассчитанное количество микроорганизмов конкретного морфологического типа на чашке, идентифицированных как целевые;
в - количество колоний, подтвержденных как целевые, из числа отобранных на идентификацию;
А - количество типичных колоний, отобранных на идентификацию;
С - общее количество типичных колоний данного морфологического типа на чашке.
Например, в = 3, А = 5, С = 20, тогда а = 3/5·20 = 12.
Затем вычисляют суммарное количество целевых микроорганизмов всех морфологических типов на основе описанного расчета в исследованном объеме/на чашке.
Результат пересчитывают на нормируемый объем.
9.5 Титрационный метод определения в воде обобщенных и общих колиформных бактерий
Из посевов в среду накопления, в которых отмечены помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение, проводят высев петлей на сектора среды Эндо, или хромогенные среды, или на поверхность сред на подложке с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на среде инкубируют при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч.
Результат считают положительным при наличии в среде накопления помутнения и газообразования (при изменении цвета среды), а при высеве на подтверждающую среду рост типичных колоний.
Примечание - На среде Кесслера признаки образования кислоты отсутствуют. Среда не содержит индикатора и не меняет цвет. Рост общих колиформных бактерий, ферментирующих лактозу, сопровождается помутнением и газообразованием, о степени которого судят по подъему пузырька газа в поплавке. Рост бактерий, не ферментирующих лактозу, вызывает слабое помутнение среды без газообразования.
Идентификацию обобщенных или общих колиформных бактерий в высевах на плотные дифференциальные среды проводят:
- если в среде накопления имеет место сомнительная реакция (небольшое газообразование или только помутнение);
- если на плотных средах выросли колонии с недостаточно четкими дифференциальными признаками. В этом случае после снятия петлей подозрительных колоний подтверждают принадлежность этих колоний к грамотрицательным бактериям, выполняя окраску по Граму или тест Грегерсена, оксидазный тест и способность к образованию кислоты и газа при посеве 1-2 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора на полужидкую среду с глюкозой с последующей инкубацией посевов при температуре (37±1)°C в течение (21±3) ч при определении обобщенных колиформных бактерий или в среду Гиса с лактозой при определении общих колиформных бактерий. Отрицательный ответ дают в том случае, если:
- в среде накопления отсутствуют признаки роста;
- на секторах среды Эндо (хромогенных средах или на поверхности сред на подложке) отсутствует рост;
- на секторах среды Эндо или на других использованных питательных средах (например, хромогенных средах или на поверхности сред на подложке) выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные, с неровными краями, расплывчатые);
- все колонии оказались оксидазоположительными;
- в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования.
В протоколе исследования записывают следующее: "не обнаружены в нормируемом объеме".
Допускается для реализации титрационного метода использовать тест-системы, основанные на технологии обнаружения бактериальных ферментов со специфическими субстратами (например, Colilert-18, системы Quanti-Tray 96 и 2000 или аналогичные) в соответствии с инструкцией производителя, разрешенных к применению в установленном порядке.
9.6 Титрационный метод определения в воде E.coli
Для определения в воде E.coli титрационным методом каждый объем воды или ее разведения засевают в накопительную среду (например, лактозо-пептонную среду с поплавком, среду Кесслера с поплавком, среду Макконки с поплавком или другие среды, разрешенные к применению) в трех повторностях (см. 9.6).
Учету подлежат те посевы в накопительной среде, в которых обнаружены помутнение/изменение цвета, кислота и газ, а при последующем высеве на среду Эндо (в т.ч. в среду Эндо с модификациями, см. примечания к разделу 6) выросли типичные, характерные для E.coli, темно-красные колонии с металлическим блеском и отпечатком на обратной стороне среды. Для подтверждения выбирают 2-3 типичные колонии с каждого сектора плотной среды, проводят для каждой среды окраску по Граму (можно использовать также тест Грегерсена по В.5) и оксидазный тест, засевают в пробирки со средой, содержащей триптофан для установления способности продуцировать индол, и на полужидкую среду с лактозой или в лактозный бульон с борной кислотой, посевы инкубируют при температуре (44±0,5)°C. Положительный ответ на наличие в среде E.coli дают после инкубации посевов при помутнении и образовании газа. Подтверждение наличия продукции индола определяют одним из общепринятых методов (реактивом Ковача или Эрлиха, индикаторной полоской).
Оптимальным является высев на чашки с хромогенными средами или на среды подложки, что позволяет сократить исследование на 24 ч.
Допускается для реализации титрационного метода использовать тест-системы, основанные на технологии обнаружения бактериальных ферментов со специфическими субстратами (например, Colilert-18, системы Quanti-Tray 96 и 2000 или аналогичные) в соответствии с инструкцией производителя, разрешенных к использованию в установленном порядке.
9.7 Определение энтерококков [3]
9.7.1 Определение энтерококков в воде методом мембранной фильтрации
Определение энтерококков в воде может быть выполнено на среде Сланеца-Бартли, энтерококкагаре (среды с ТТХ и азидом натрия) или на аналогичных средах.
Посев осуществляют методом мембранной фильтрации по 8.2. Рекомендуемые объемы для посева в зависимости от типа исследуемой воды представлены в приложении А.
Учету подлежат розовые или бордовые колонии различных оттенков, равномерно окрашенные или с более темным центром.
Идентификация типичных колоний может быть осуществлена двумя способами:
а) мембранный фильтр с посевом перекладывают на поверхность желчно-эскулинового агара с азидом натрия для определения гидролиза эскулина в присутствии азида и инкубируют в термостате при температуре (44±0,5)°C в течение 2 ч. После инкубации учитывают результат путем подсчета колоний, под которыми среда приобрела коричнево-черный оттенок;
б) выбирают по две-три колонии каждого типа; для каждой из выбранных колоний:
1) выполняют окраску по Граму (см. приложение Д) и микроскопируют. При обнаружении в мазках грамположительных полиморфных, как правило, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков дают положительный ответ,
2) делают пересев на секторы на солевой агар с ТТХ и инкубируют посевы в течение 24-48 ч при температуре (37±1)°C; кишечные энтерококки на среде дают равномерный нежный рост на протяжении всего штриха. Другие бактерии на этой подтверждающей среде не растут,
3) выполняют каталазный тест. Для этого петлей наносят каплю дистиллированной воды на предметное стекло, в котором растирают исследуемую культуру. После подсушивания на воздухе добавляют каплю 3%-ной перекиси водорода. При отсутствии пузырьков газа считают тест каталазаотрицательным. В качестве контрольной каталазаположительной культуры используют любой вид стафилококков.
9.7.2 Определение энтерококков в воде методом мембранной фильтрации на хромогенных средах
Определение энтерококов в воде может быть выполнено на плотных хромогенных средах, представленных в таблице 1, или на аналогичных средах.
После инкубации проводят подсчет типичных колоний.
При необходимости подтверждения выросших колоний подсчет осуществляют по 9.7.1.
Таблица 1 - Параметры инкубации и характеристика колоний фекальных кишечных энтерококков на хромогенных питательных средах
Питательная среда | Инкубация посевов | Характер роста Колоний кишечных энтерококков | Рост посторонних бактерий (не учитывают) |
Энтерококковый агар Chromocult | При температуре (37±1)°C в течение 24-48 ч | Красные, темно-бордовые, диаметром от 0,5 до 2 мм и розовые | Бесцветные, сине-фиолетовые или бирюзовые колонии. Грамотрицательные бактерии не растут |
KF Стрептококковый агар (KF Streptococcus Agar) | При температуре (37±1)°C в течение 46-48 ч | Красные, розовые | Оранжевые, желтые, белые. Грамотрицательные бактерии ингибируются |
Основа хромогенного агара для кишечных энтерококков (m-EI Chromogenic Agar Base) | При температуре (42±1)°C в течение 18-24 ч | Синие, при добавлении в среду ТТХ красные | Колонии другого цвета не учитывают |
Учет результатов проводят по 9.4.
9.7.3 Определение энтерококков в воде титрационным методом
Анализируемый объем воды и ее разведения засевают параллельно в три ряда накопительной щелочно-полимиксиновой среды или жидкой хромогенной среды. Рекомендуемые объемы для посева в зависимости от типа исследуемой воды представлены в приложении А.
В качестве положительных результатов отмечают наличие аспидно-черных, выпуклых колоний с металлическим блеском, ровными краями (Enterococcus faecalis), а также мелких сероватых колоний (Enterococcus faecium, Enterococcus durans). На азидной среде Сланеца-Бартли и энтерококкагаре энтерококки образуют крупные выпуклые, темно-малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром. Для подтверждения наличия энтерококков по две-три колонии каждого типа микроскопируют, выполняют каталазный тест и проверяют способность роста на солевом агаре с ТТХ.
Альтернативным способом подтверждения является пересев типичных колоний на желчно-эскулиновый агар с азидом натрия в виде макроколоний для определения гидролиза эскулина в присутствии азида. О гидролизе эскулина будет свидетельствовать потемнение среды под посевом и вокруг макроколонии.
При использовании жидких хромогенных сред проводят учет положительных результатов в соответствии с инструкцией производителя.
9.7.4 Ускоренный метод определения энтерококков в воде титрационным методом
Для накопления общих и обобщенных колиформных бактерий и одновременно энтерококков титрационным методом при анализе воды используют глюкозо-лактозо-пептонную среду. Сначала делают высев из глюкозо-лактозо-пептонной среды для определения общих и обобщенных колиформных бактерий, затем энтерококков. Из всех емкостей с глюкозо-лактозо-пептонной средой, в которых имелось помутнение, независимо от наличия или отсутствия газа делают высев со дна пробирки на сектора одной из сред (МИС, азидной среды или энтерококкагара) путем троекратного нанесения материала бактериологической петлей диаметром от 2 до 3 мм для посева штрихом. Среды инкубируют в течение 24 ч при температуре (37±1)°C. Посев штрихом делают с таким расчетом, чтобы к концу штриха получить изолированные колонии, и оценивают результат по наличию роста характерного для каждой среды цвета колоний энтерококков, указанных в 9.7.1.
Допускается для определения энтерококков использование тест-систем, основанных на технологии обнаружения бактериальных ферментов со специфическими субстратами (например, Enterolert-DW, системы Quanti-Tray 96 и 2000 или аналогичные), которые применяют в соответствии с инструкцией производителя.
9.7.5 Качественный метод определения кишечных энтерококков с использованием селективных питательных сред (например, Readycult Enterococci 100) или хромогенных сред (качественный метод)
Посевы инкубируют в течение 18-24 ч при температуре (37±1)°C.
После инкубации посевов проводят учет результатов следующим образом:
- бактерии кишечных энтерококков отсутствуют, если цвет среды не изменился или отмечено помутнение среды без изменения цвета;
- кишечные энтерококки обнаружены, если цвет среды изменился;
- при перемешивании цвет среды не должен изменяться. Изменение цвета среды даже в верхней части флакона также подтверждает наличие кишечных энтерококков в пробе воды (реакция с хромогенным субстратом X-GLU).
9.8 Определение бактерий Pseudomonas aeruginosa
Рекомендуемые объемы для посева в зависимости от типа исследуемой воды представлены в приложении А.
9.8.1 Определение методом обогащения (качественный метод)
Качественный метод обнаружения P.aeruginosa основан на культивировании исследуемого образца в среде обогащения с дальнейшим высевом обогащенной смеси на селективные и/или дифференциально-диагностические плотные питательные среды, с последующей идентификацией выделенных штаммов по культуральным и биохимическим свойствам. Принцип обогащения основан на росте псевдомонад на средах с минимальной концентрацией питательных веществ.
В качестве среды накопления используют цитратную среду Бонде с кристаллическим фиолетовым, или среду Дрейка, или аналогичные. Среда Дрейка предпочтительнее для посева проб с низким содержанием биологического загрязнения, тогда как среда Бонде - для воды с более высоким уровнем биологического загрязнения. Допускается использование тест-наборов (например, Pseudolert), основанных на технологии обнаружения бактериальных ферментов со специфическими субстратами в соответствии с инструкцией производителя.
Инкубацию посевов осуществляют при температуре (37±1)°C в течение 24-48 ч. Допустимо инкубировать посев сточных вод при температуре (42±1)°C. Первичный учет проводят в течение (24±2) ч.
При отсутствии помутнения и пленки на поверхности среды посевы инкубируют не более 48 ч.
Примечания
2 Перед высевом на плотные селективные среды емкость с посевом не следует встряхивать. Посев выполняют из верхнего слоя среды.
При помутнении среды накопления и/или при образовании на поверхности тонкой прозрачной пленки проводят пересев на сектора цетримидного агара. Петлей забирают пленку с поверхности, посев проводят методом истощающего штриха для получения изолированных колоний. Посевы помещают в термостат при температуре (37±1)°C на 48 ч, первичный учет - через 24 ч.
На цетримидном агаре бактерии вида P.aeruginosa могут образовывать плоские или плоско-выпуклые блестящие, или матовые колонии цвета среды (светло-салатные) или разных оттенков зеленого цвета с ровными или мелко-иссеченными краями. Под скоплениями колоний среда часто окрашивается в зеленый, салатовый или желтый цвета из-за образования пигментов феназинового ряда: пиоцианина и (или) флюоресцеина. Образование пигментов и степень их выраженности зависит от производителя и серии среды и может варьироваться в значительных пределах. Подтвердить образование флюоресцеина можно путем кратковременного облучения посевов ультрафиолетовой лампой Вуда с максимальным излучением на длине волны (360±20) нм. Определение флюоресцеина носит вспомогательный характер, так как его образование не является видоспецифичным и выполняется в случае отсутствия пигмента пиоцианина.
Если на цетримидном агаре отмечается рост колоний, образующих сине-зеленый пигмент пиоцианин, результат анализа считают положительным.
Если отмечается рост только колоний, образующих пигмент флюоресцеин (определяется с использованием УФ-лампы), или колоний без пигмента, то по две-три колонии каждого морфологического типа пересевают в две пробирки: в одну - со скошенным питательным агаром, в другую - со скошенной средой № 9. При большом количестве колоний, требующих идентификации, допускается их пересев на поверхность чашек Петри тех же сред, однако при таком способе посева пигментообразование может быть выражено хуже. На одной чашке Петри размещают не более 9-12 колоний. Посевы на среде № 9 инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (24±2) ч. Посевы на питательном агаре инкубируют при температуре (42±1)°C в течение (24±2) ч.
После инкубации вначале учитывают колонии, образующие сине-зеленый пигмент пиоцианин на среде № 9, проводят оксидазный тест и тест Грегерсена для определения грам-принадлежности (см. приложение Д).
Оксидазоположительные, грамотрицательные колонии, образующие пигмент пиоцианин, относят к виду P.aeruginosa.
При отсутствии пигментообразующих колоний для идентификации отбирают колонии, способные расти при температуре (42±1)°C, для которых проводят оксидазный тест, тест Грегерсена, и определяют биохимические свойства, используя тест-системы для выявления неферментирующих бактерий (миниатюрные биохимические ряды, например API-системы) или аналогичные, предназначенные для ручной или автоматической идентификации.
Допускается использование тест-систем на основе колориметрического и флуоресцентного методов анализа с использованием тест-наборов, основанных на технологии обнаружения бактериальных ферментов со специфическими субстратами (например, Pseudalertt, системы Quanti-Tray 96 и 2000 или аналогичные) в соответствии с инструкцией производителя.
9.8.2 Определение методом мембранной фильтрации
Исследование, идентификацию и учет результатов проводят в соответствии с ГОСТ ISO 16266.
10 Определение патогенных бактерий рода Salmonella и рода Shigella
Для идентификации патогенных бактерий необходимо иметь набор сывороток Н-, О-антигенов для идентификации бактерии рода Salmonella и рода Shigella.
10.1 Определение патогенных бактерий рода Salmonella[3]
10.1.1 Качественный метод
Примечания
Качественный анализ сточной воды до очистки ввиду ее высокого бактериального антагонизма проводить не рекомендуется.
При исследовании проб с низкими уровнями контаминации возможно применение дополнительного этапа неселективного обогащения в забуференной пептонной воде.
Посевы воды в среде накопления инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (24±2) ч. Для повышения селективности допускается инкубация в средах селективного обогащения при температуре (42±1)°C в течение (24±2) ч.
Инкубацию посевов в селективных средах выполняют согласно требованиям настоящего пункта.
10.1.2 Количественный метод бактерий рода Salmonella
Количественный анализ Salmonella проводят титрационным методом, который основан на накоплении бактерий при посеве определенного объема воды в питательную среду, в соответствии с объемами, необходимыми для расчета по таблицам Хоскинса-Мура (см. приложение Б).
Объем исследуемой пробы для посева и количество повторов выбирают в зависимости от предполагаемой степени ее бактериального загрязнения.
Для обнаружения Salmonella используют не менее двух сред накопления по нижеприведенным схемам (целесообразно использовать РНС- и магниевую среду).
Допускается использование стандартизованных коммерческих сред (RVS broth, Selenite cystyne broth или аналогичных), разрешенных к применению в установленном порядке.
Для обнаружения Salmonella в сточных водах используют не менее двух сред накопления по следующим схемам:
Посевы воды в среде накопления инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (22±2) ч. НВЧ проводят в соответствии с таблицей Б.1.
10.1.3 Выделение бактерий рода Salmonella из среды накопления на плотных селективно-дифференциальных средах
Определяют наличие признаков роста бактерий в средах накопления через (24±2) ч инкубации посевов. Из каждой среды селективного обогащения, где отмечено равномерное помутнение, проводят высев на две плотные селективно-дифференциальные среды для выделения Salmonella одним из способов для получения изолированного роста колоний. С этой целью можно использовать висмут-сульфитный агар, хромогенные среды, ксилозо-лизин-дезоксихолатный (XLD) агар, дезоксихолатный цитратный агар, XLT-4 агар, SS-arap и другие среды, разрешенные для применения.
Примечание - На среде XLT-4 агар полностью подавляется рост протея.
Засеянные емкости со средой накопления без наличия признаков роста оставляют при температуре (37±1)°C в течение не более (46±2) ч, после чего делают высев на две плотные селективно-дифференциальные среды, а посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат.
Просмотр посевов проводят через (24±2) ч инкубации при температуре (37±1)°C на плотной селективно-дифференциальной среде и отбирают колонии, подозрительные относительно наличия Salmonella. При отсутствии подозрительных колоний чашки с селективными средами оставляют в термостате еще на (20±2) ч. При отсутствии подозрительных на предмет наличия колоний Salmonella через (46±2) ч дают окончательный отрицательный ответ.
На висмут-сульфитном агаре Salmonella растут в виде аспидно-черных колоний с металлическим блеском участка среды вокруг колонии - так называемое "зеркало", и черным отпечатком под колонией. На средах разных производителей морфология колоний может отличаться. Цвет колоний может варьировать от светло-серого до черного, а вместо металлического блеска вокруг колоний может появляться темный ореол. Наличие выраженного отпечатка под колонией является наиболее стабильным признаком.
Исключение в этом отношении составляют S.paratyphi A, некоторые Salmonella из группы С и других групп, которые при росте на висмут-сульфитном агаре образуют нежные зеленоватые колонии с темным центром и без него, слегка выпуклые с ровными краями.
На агаре Плоскирева Salmonella образуют прозрачные или нежно-розовые колонии.
На хромогенном агаре (РАМБАХ-агар) колонии Salmonella окрашены в пурпурный цвет; микроорганизмы, не являющиеся Salmonella, имеют синий цвет или не окрашиваются ни одним из хромогенов среды. Колиформные бактерии растут в виде сине-зеленых или сине-фиолетовых колоний. Остальные энтеробактерии (Shigell, Proteus) и грамотрицательные бактерии, такие как Pseudomonas, вырастают в виде бесцветных или желтоватых колоний.
На ксилозо-лизин-дезоксихолатном агаре (среде XLD) Salmonella образуют колонии красного цвета с черным центром за счет образования сероводорода.
На дезоксихолатном цитратном агаре колонии Salmonella, образующие сероводород, темные.
На XLT-4 агаре колонии Salmonella бесцветные с выраженным черным центром. Под одиночными колониями среда желтеет, под скоплениями - краснеет.
На SS-агаре Salmonella образуют желтоватые колонии с черным центром.
10.1.4 Идентификация бактерий рода Salmonella по биохимическим и антигенным свойствам
Для подтверждения выросших колоний к роду Salmonella проводят идентификацию по биохимическим и серологическим тестам.
10.1.4.1 Биохимические свойства
При обнаружении на чашках колоний, подозрительных на предмет наличия Salmonella, по две-три изолированных колонии с каждой чашки снимают для посева в пробирки с комбинированными средами для определения биохимических свойств бактерий, подтверждающих их принадлежность к роду Salmonella (типа Ресселя, Клиглера, Олькельницкого и др.).
Примечания
1 Параллельно колонии можно снять на фенилаланин, что позволит, как только появится видимый рост на скошенной поверхности, капнуть хлорное железо. Положительная реакция позволяет уверенно исключить протей.
2 Параллельный пересев колоний на среду XLT-4 также позволяет исключить протей, который на данной среде не растет.
На вышеперечисленных комбинированных средах бактерии рода Salmonella ферментируют глюкозу с образованием газа, не ферментируют лактозу и сахарозу, не образуют индол, ферментируют маннит и дульцит, образуют сероводород, не гидролизуют мочевину. В случае ферментации глюкозы реакция среды становится кислой и цвет индикатора в столбике изменяется. Если при расщеплении глюкозы помимо кислоты образуется газ, в среде появляются пузырьки. Появление желтой окраски в скошенной части агара свидетельствует о ферментации лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации лактозы в среде Клиглера и Ресселя. Образование сероводорода устанавливают по почернению среды.
При росте культуры, гидролизирующей мочевину, среда приобретет диффузный яркий красно-малиновый цвет, что характерно для бактерий рода протеев. Культуры, не расщепляющие лактозу и мочевину, но ферментирующие глюкозу, образующие сероводород, подвергают дальнейшему изучению для определения серовара с определением серологических свойств.
Для определения родовой принадлежности культур допускается использование тест-систем биохимической идентификации для биохимической дифференциации по специфическим белкам (например, Lachema, API 20Е, Rapid 20Е, ID 32E, Densi-La-Meter, BioMerieux или аналоги), разрешенных к применению приборов и автоматических анализаторов в соответствии с нормативными документами или инструкцией производителя.
10.1.4.2 Антигенные свойства
Следующим этапом идентификации Salmonella является изучение более устойчивой антигенной структуры в реакции агглютинации на стекле с O-, H- и Vi- агглютинирующими диагностическими сыворотками.
При серологической идентификации культур вначале определяют их принадлежность к виду Salmonella enterica с поливалентной сывороткой Salmonella enterica (A, B, C, D, Е), в случае получения отрицательного результата проводят агглютинацию с сыворотками редких групп.
Если культура агглютинируется одной из поливалентных O-сывороток, то определяют характерные для каждой серологической группы O-антигены (соматические), а затем жгутиковые Н-антигены, которые представлены двумя фазами - H1 и H2.
Для проведения агглютинации используют диагностические сальмонеллезные сыворотки, адсорбированные для РА, лиофилизат для диагностических целей согласно инструкции по применению.
"++++" - отчетливый агглютинат при полном просветлении жидкости;
"+++" - отчетливый агглютинат на фоне мутноватой жидкости;
"++" - незначительный агглютинат на фоне мутной жидкости;
"+" - незначительное количество агглютината на фоне мутной жидкости;
"-" - гомогенная мутная жидкость.
Положительной считают реакцию агглютинации интенсивностью не менее чем на +++.
В некоторых случаях исследуемая культура обладает свойствами неспецифически выпадать в осадок в физиологическом растворе или агглютинировать во всех или практически всех групповых O-сыворотках. Это происходит при переходе культуры из S-(гладкой) в R-(шероховатую) форму. Штаммы, находящиеся в R-форме, обладают самопроизвольной агглютинацией. Их дальнейшее серотипирование не представляется возможным без дополнительных манипуляций. Такие штаммы пересевают на слабощелочной агар для того, чтобы выбрать колонию с ровными краями возвратить штамм в S-форму и повторить агглютинацию.
Серологическая классификация Salmonella представлена в схеме Кауфмана-Уайта, которая является каталогом диагностически значимых антигенов Salmonella.
10.1.5 Учет результатов
10.2 Определение патогенных бактерий рода Shigella[3]
10.2.1 Выполнение исследования определение бактерий рода Shigella культуральным методом
Для выявления Shigella используют две накопительные среды: селенит-цистиновый бульон и селективный бульон для бактерий рода Shigella, приготовленные по ГОСТ 32010.
Посевы инкубируют при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч. После инкубации посевов при наличии признаков роста (помутнение среды) из каждого флакона делают высевы на две чашки со средой: XLD агар, ЭМС (агар с эозиновым метиленовым синим), среду Плоскирева (далее - бактоагар Плоскирева) с антибиотиками, Salmonella/Shigella агар (SS агар), среду Эндо.
Посевы помещают в термостат дном вверх при температуре (37±1)°C и инкубируют в течение 18-24 ч.
10.2.2 Учет результатов
Типичные колонии бактерий рода Shigella вырастают:
- на ксилозо-лизин-дезоксихолатном (XLD) агаре - в виде красных колоний;
- на агаре ЭМС - в виде круглых, прозрачных нежных, бесцветных колоний. Колонии Shigella sonnei более плотные, иногда белесоватые, с изрезанными краями;
- на агаре Плоскирева - в виде бесцветных прозрачных нежных колоний, слегка возвышающихся над поверхностью агара (Shigella flexneri). Колонии Shigella sonnei иногда бывают белесоватые, приобретающие через 48 ч слегка розовый оттенок;
- на Salmonella/Shigella агаре, на средах Эндо - в виде круглых бесцветных или слегка розоватых колоний.
При обнаружении на чашках колоний, подозрительных на Shigella, по две-три изолированные колонии с каждой чашки снимают для посева в пробирки с комбинированными средами для определения биохимических свойств бактерий, подтверждающих их принадлежность к роду Shigella (типа Клиглера, Олькельницкого и др.). Параллельно выполняют посев уколом в столбик полужидкого агара для определения подвижности.
Посевы инкубируют при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч.
На вышеперечисленных комбинированных средах ферментируют глюкозу без образования газа (S.flexneri VI серотипа может давать слабое газообразование из глюкозы), не ферментируют лактозу и сахарозу, не образуют сероводород, не гидролизуют мочевину.
Все Shigella неподвижны, поэтому при посеве в столбик полужидкого агара бактерии рода Shigella растут только по ходу укола, столбик среды остается прозрачным.
Примечание - Выполнение теста на оксидазу позволяет исключить бактерии вида Plesiomonas shigeloides, которые обладают аналогичными с бактериями рода Shigella свойствами, но положительны по цитохромоксидазе.
Для определения родовой принадлежности выделенных культур допускается использование тест-систем по биохимической идентификации (например, Lachema, API 20Е, Rapid 20Е, ID 32E, Densi-La-Meter, BioMerieux или аналоги), разрешенных к применению на территории России приборов и автоматических анализаторов в соответствии с нормативными документами или инструкцией производителя.
При необходимости выполняют серологическую идентификацию выделенных колоний.
11 Определение колифагов в воде методом прямого посева [3]
В основе методики определения лежит способность колифагов инфицировать бактериальную культуру E.coli и формировать зоны лизиса ("бляшки") на бактериальном газоне штамма-хозяина на питательном агаре при температуре (37±1)°C через (21±3) ч.
11.2 Выполнение исследования
Объем воды для посева выбирают в зависимости от степени ее загрязнения с таким расчетом, чтобы на чашках диаметром от 90 до 100 мм образовалось до 200 БОЕ, а на чашках диаметром от 140 до 150 мм - до 300 БОЕ, без сливных зон.
Примечание - При использовании хлороформа следует пользоваться исключительно стеклянной посудой.
11.3 Учет результатов
где a - сумма бляшек на чашках;
V - объем исследуемой воды.
где a - сумма бляшек на чашке;
При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считают недействительным.
11.4 Постановка контролей
Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить контрольный посев на лизогенность тест-штамма E. coli К12 F+Str-r.
Для проверки культуры на лизогенность необходимо использовать новую пробирку с культурой, хранящейся на полужидком агаре. В стерильную чашку Петри помещают 1 мл бактериальной взвеси и заливают расплавленным и остуженным до температуры (49±1)°C питательным агаром, инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (21±3) ч. Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Наличие зон лизиса в контрольном посеве свидетельствует о спонтанно проявившемся свойстве культуры продуцировать фаги или контаминации ее колифагом в процессе работы. Использование в работе лизогенной культуры запрещается. Необходимо получить новую лиофилизированную культуру.
11.5 Подтверждение фаговой природы лизиса
В случае обнаружения на чашках сомнительных бляшек или артефактов следует провести исследование на подтверждение фаговой природы лизиса.
При необходимости проведения комиссионных испытаний полученную взвесь можно хранить в холодильнике при температуре (6±2)°C в течение года.
12 Санитарно-паразитологические методы исследований [3]
12.1 Метод осаждения
Применяют для проб сточной воды, а также природной, в которой содержится большое количество взвесей.
В емкости с отобранной пробой добавить один из нижеприведенных коагулянтов.
После отправляют в центрифугу в течение 5 мин при скорости от 1500 до 2000 об/мин и сливают надосадочную жидкость. Если в пробе содержится много взвесей, следует продолжить отмывку до прозрачной надосадочной жидкости.
После осаждения хлопьев осторожно (без взбалтывания осадка) удаляют способом сифонирования надосадочную жидкость, оставив над осадком от 4 до 5 см воды.
Контролируют значение pH содержимого центрифужных флаконов. Оно должно составлять от 6,0 до 6,5 ед. pH во избежание повторного образования хлопьев. Для доведения рН до нужного значения используют раствор гидроксида натрия 1 Н.
Устанавливают центрифужные флаконы в центрифугу и запускают ее при максимальном ускорении 7200g в течение 12 мин без торможения во время фазы замедления. Непосредственно после окончания центрифугирования извлекают центрифужные флаконы из центрифуги и осторожно удаляют надосадочную жидкость способом сифонирования, оставив над осадком от 1 до 2 см воды.
Доводят объем дистиллированной водой и запускают процесс центрифугирования при ускорении 1100g в течение 15 мин без торможения во время фазы замедления, при наличии такой технической возможности, а затем сливают надосадочную жидкость. Если в пробе содержится много взвесей, следует продолжить отмывку до прозрачной надосадочной жидкости.
Далее добавляют в пробирку дистиллированную воду и проводят фильтрование полученной суспензии.
12.2 Флотационный метод исследования
12.2.1 Приготовление флотационных растворов
12.2.2 Ход исследования
12.3 Метод последовательной фильтрации через систему прозрачных аналитических трековых мембран
Профильтрованную в отдельную емкость пробу воды повторно фильтруют, используя АТМ с диаметром пор 2,5 мкм, которую укладывают на фритту фильтродержателя между двумя уплотнительными кольцами из полиэтилена или обрезиненного лавсана (поставляются в комплекте с АТМ).
При использовании прибора для фильтрования типа ПВФ-142Б(К) с двумя фильтровальными ячейками АТМ с диаметром пор 4,0 мкм и одну АТМ с диаметром пор 2,5 мкм размещают в одном филь-тродержателе для последовательного фильтрования. На верхнюю фритту фильтродержателя прибора для фильтрования помещают АТМ с диаметром пор 4,0 мкм и предфильтр с размером пор 25,0 мкм, на нижнюю фритту фильтродержателя через вкладыш (входит в состав фильтродержателя) помещают АТМ с диаметром пор 2,5 мкм. Обе мембраны уплотняют кольцами из полиэтилена или обрезиненного лавсана (поставляются в комплекте с АТМ).
Исследование полученного концентрата на яйца, личинки гельминтов и цисты патогенных простейших проводят, применяя микроскопию АТМ на стеклах, как описано выше, или используя флотационный или другие методы выделения и видовой идентификации паразитарных патогенов.
После фильтрации пробы воды через прозрачную АТМ диаметром пор 2,5 мкм на фильтровальном приборе или при получении концентрированного смыва АТМ тщательно высушивают в лотке на воздухе при комнатной температуре.
Затем АТМ фиксируют в смеси Никифорова или в этаноле 96% 5 мин.
После фиксации мембрану вновь тщательно высушивают в лотке на воздухе и затем окрашивают фильтр АТМ в кювете (лотке, чашке Петри) по Циль-Нильсену (для окрашивания могут применять специально для этого предназначенные готовые комплекты реагентов) в течение 20 мин.
После окраски фильтры промывают.
Далее проводят обесцвечивание (дифференцируют) 5%-ным раствором серной или соляной кислоты в течение 10 с и снова промывают.
Результат окрашивания: ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром от 5 до 6 мкм с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержанием (можно наблюдать наличие четырех веретенообразных темноокрашенных спорозоитов) на синем (сиреневом) или зеленом основном фоне.
12.4 Учет результатов окрашивания
Микроскопии подлежит весь объем полученного осадка пробы с учетом всех паразитарных патогенов и с определением их видовой принадлежности. Полученное количество патогенов соответствует их количеству в объеме исследованной пробы.
12.5 Люминесцентная микроскопия для выявления цист и ооцист паразитарных простейших
12.5.1 Окраска препаратов для последующей люминесцентной микроскопии
Метод основан на окрашивании препаратов, приготовленных из концентрированного осадка воды (см. 7.2.1), специальным красителем, молекулы которого под действием ультрафиолета возбуждаются, начинают испускать кванты света в длинноволновой области и создают цветное свечение ооцист криптоспоридий, при этом достигаются высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь поля зрения.
Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из концентрированного осадка после обработки материала детергентом (синтетические ПВА) с последующим отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением предварительно сконцентрированной пробы на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения pH (6,8-7,0). С этой целью осадок нейтрализуют несколькими каплями 1М раствора соляной кислоты или 1М едкого натра (в зависимости от метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью лабораторного pH-метра определяют уровень pH (оптимально 6,8) осадка. В качестве контрастирующего красителя может быть применен краситель типа Флюоро-Стейн или аналогичные красители с такими же характеристиками.
Примечание - Приготовление раствора соляной кислоты 1М - по ГОСТ 25794.1-83 (2.1), приготовление раствора едкого натра 1М по ГОСТ 25794.1-83 (1.4).
12.5.2 Подготовка к окрашиванию флюорохромными красителями
Промывание мазков в процессе окраски следует проводить только дистиллированной водой.
В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.
При окраске мазков необходимо избегать неполного обесцвечивания и не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.
Примечание - При окраске флюорохромными красителями не допускается подогревать мазки и пользоваться накладками из фильтровальной бумаги.
12.5.3 Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Циль-Нильсена для определения ооцист криптоспоридий
_______________
12.5.3.1 Фиксация препарата
Полученный концентрированный смыв после фильтрации питьевой воды или "висячую каплю" из осадка пробы поверхностной воды наносят тонким слоем на предметное стекло и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
Фиксацию препарата проводят одним из нижеприведенных способов.
Пинцетом или специальными щипцами берут за боковые концы препарат и три раза медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания препарата в пламени не должна превышать 3-5 с. Затем стекла помещают на специальную подставку ("рельсы") для окрашивания.
Предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при температуре от 35°C до 38°C. Затем температуру повышают до 100°C-105°C и спустя 10 мин шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу.
Высушенные и фиксированные мазки должны незамедлительно окрашиваться.
12.5.3.2 Процедура окраски
Препараты помещают на подставку ("рельсы") таким образом, чтобы они не касались друг друга и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была (был) направлена (направлен) в одну сторону.
На каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок.
Наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый препарат оставляют на 5 мин для его полного прокрашивания.
Пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу.
Осторожно смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. При промывании препаратов следует использовать холодную воду или воду комнатной температуры.
Перед тем как нанести на стекло следующий раствор, щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют для того, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление следующего реактива.
Препарат обесцвечивают 3 мин одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка.
Тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение не более 1 мин (при этом не следует превышать экспозицию) 0,3%-ным раствором метиленового синего.
Вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло для того, чтобы стекала вода.
Высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.
Примечание - Не следует промокать препарат.
Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.
Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром от 5 до 6 мкм с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержанием (можно наблюдать наличие четырех веретенообразных темно-окрашенных спорозоитов) на синем (сиреневом) или зеленом фоне.
13 Исследование воды на цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий методом иммуномагнитного разделения и мечения флуоресцирующими антителами
Метод предназначен для определения специфических антигенов простейших цист лямблий и ооцист криптоспоридий в исследуемой пробе: выявлении одного из антигенов либо одновременно обоих.
Метод представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антигена в комплексе антиген-антитело (АГ-АТ) происходит с помощью иммуномагнитной суспензии (для выделения ооцист криптоспоридий и цист лямблий соответственно).
Примечание - Возможно применение диагностических наборов, в состав которых могут входить контрастирующие вещества, например метящий раствор 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Все изменения в проведении реакции регулируются в соответствии с инструкцией по применению диагностического теста.
Метод проводят с применением реактивов, реагентов и расходных материалов в соответствии с инструкцией производителя, в том числе слайды типа SuperStick (предметные стекла): S100-1 (одно окно), S100-2 (два окна), S100-3 (три окна); фосфатно-солевой моющий буфер PBS 20Х (pH=7,4); магнитный штатив MagnetOn 4Т; магнитная ручка SepPen; наконечники для магнитной ручки; флюоро-Стейн (краситель) - 0,1%-ный водный раствор калькофлюора белого.
Исследование состоит из нескольких этапов и процедур.
13.1 Подготовка проб воды к исследованию
Примечание - Все иммунореагенты и буферные растворы диагностического набора перед использованием выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре.
13.2 Процедуры связывания и промывки цист лямблий и ооцист криптоспоридий
13.3 Процедуры диссоциации
13.4 Процедура детекции (идентификации) ооцист криптоспоридий и цист лямблий методом иммунофлюоресцентного мечения
По одной капле (около 45 мкл) иммунореагента (например, AquaGlo G/C или аналог) вносят в каждую лунку предметного стекла (например, SuperStick или аналог), на котором находятся предварительно подсушенная проба и контроль. При необходимости с помощью аппликатора или стеклянной палочки распределяют иммунореагент по всей поверхности лунки, не касаясь поверхности самой лунки. Рабочий раствор иммунореагента предварительно разведен из концентрата, поэтому, когда его вносят на поверхность лунок, дальнейших разведений не требуется.
Примечание - Из представленного в диагностическом наборе концентрированного иммунореагента готовят рабочий раствор путем разбавления концентрата буфером DB в 20 раз.
Затем предметные стекла помещают в ячейку влажности в темноте и инкубируют не менее 30 мин при температуре 37°C или не менее 40 мин при комнатной температуре (допускается более длительное время инкубации). Наносят от 50 до 100 мкл фосфатно-солевого буфера в каждую лунку предметного стекла (например, SuperStick или аналога) и выдерживают 2 мин. Аккуратно с лунок предметного стекла удаляют излишек жидкости (с помощью фильтровальной бумаги по ГОСТ 12026-76 или пастеровской пипетки), при этом избегают перемешивания пробы.
13.5 Процедура мечения
Для снижения неспецифической флуоресценции и выделения фона для лучшего наблюдения яблочно-зеленой флуоресценции цист G. lamblia и ооцист C. parvum необходимо нанести по одной капле контрастирующего красителя в каждую лунку предметного стекла и выдержать 1 мин при комнатной температуре. Для этого наносят одну каплю фосфатно-солевого моющего буфера (PBS) в каждую лунку и выдерживают 1 мин при комнатной температуре. Аккуратно с лунок предметного стекла (например, SuperStick или аналога) удаляют излишек жидкости (с помощью фильтровальной бумаги или пастеровской пипетки), при этом избегают перемешивания пробы. Затем раскладывают предметные стекла на наклонном штативе и подсушивают в слабом токе теплого воздуха. Наносят одну каплю монтирующей среды в каждую лунку предметного стекла, накрывают лунки покровным стеклом, края можно заклеить канадским бальзамом и микроскопируют под масляной иммерсией на люминесцентном микроскопе либо на микроскопе, оснащенном насадкой "ОптиЛюм".
Примечание - Меченые препараты необходимо хранить в темном месте при температуре (5±3)°C. Не допускается замораживания меченых препаратов. Меченые препараты могут храниться в течение 72 ч и более от выполнения мечения до окончательного завершения исследования и подтверждения результатов исследований.
13.6 Люминесцентная микроскопия
Проводят исследования препаратов не менее чем при 100-кратном общем увеличении на наличие яблочно-зеленой флюоресценции, микроскопируя все поля зрения лунки предметного стекла. Перед началом микроскопии меченых препаратов необходимо предварительно просмотреть лунку с положительным контролем.
Если в образце обнаружены сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты - от округлых до овальных (8-14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину), с ярко подсвеченными темно-зелеными краями, то в результатах исследований указывают: "Цисты Lamblia (Giardia) intestinalis обнаружены", при отсутствии характерного свечения в протоколе регистрируют: "Цисты Lamblia (Giardia) intestinalis не обнаружены".
Если в образце присутствуют сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических (от 2,5 до 5 мкм в диаметре) с ярко подсвеченными краями, то в результатах исследований указывают: "Ооцисты Cryptosporidium parvum обнаружены", при отсутствии характерного свечения в протоколе регистрируют: "Ооцисты Cryptosporidium parvum не обнаружены".
Результаты регистрируют в протоколе и в журнале испытаний/исследований.
14 Обнаружение цистных форм криптоспоридий и лямблий методом полимеразной цепной реакции
14.1 Метод ПЦР позволяет определить специфические нуклеиновые кислоты криптоспоридий и лямблий и провести прямое обнаружение инфекционного агента.
14.2 Выделение ДНК из образцов воды
Подготовку проб питьевой воды для последующего выделения ДНК проводят в соответствии с 7.2.1.
14.2.1 Метод выделения ДНК криптоспоридий и лямблий из воды для ПЦР с применением ЦТАБ
Методика описана в ГОСТ Р ИСО 21571-2018* (А.3).
14.2.2 Метод выделения ДНК с использованием ДСН, гуанидин-гидрохлорида и диоксида кремния
Методика описана в ГОСТ Р ИСО 21571-2018 (А.4).
14.2.3 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстрагирования ДНК на основе гуанидина-хлороформа
Методика описана в ГОСТ Р ИСО 21571-2018 (А.5).
14.2.4 Методы выделения ДНК с использованием готовых наборов
Поскольку поверхностная и сточная вода не содержит ингибиторов ПЦР, а пробоподготовка (фильтрация и иммуносорбция) предполагает дополнительное очищение, для экстракции нуклеиновых кислот для ПЦР могут быть использованы любые сертифицированные наборы готовых реактивов, предназначенные для выделения общей (неспецифической для какого-либо биологического вида) ДНК из клинического материала, биологического материала, бактериальных и иных клеточных культур и т.д. Могут быть применены наборы, сочетающие первоначальный лизис клеточного материала с дальнейшими преципитацией нуклеиновых кислот (например, "Рибо-преп", либо сорбцией ДНК на сорбенте в виде взвеси, либо колонок типа "К-сорб", "Проба-НК", "РеалБест экстракция", ExtractDNA, QIAamp DNA Mini Kit или аналоги). Во всех этих случаях экстракцию следует выполнять в соответствии с инструкцией производителя. При первом применении нового набора следует провести контрольное выделение ДНК из эталонного образца цист лямблий и ооцист криптоспоридий.
14.3 Проведение ПЦР
14.3.1 Реакционная смесь
Объем реакции в пробе зависит от используемых приборов и расходных материалов. Рекомендуется объем пробы не менее 20 и не более 50 мкл. Реакционную смесь составляют по инструкции производителя фермента ДНК-полимеразы Taq для всех анализируемых в данном эксперименте проб, включая контрольные образцы (рекомендуется составлять смесь не менее чем для пяти проб, рекомендуемый состав приведен в таблице 2). Составленная смесь используется незамедлительно или хранится не более нескольких часов в соответствии с протоколом производителя фермента ДНК-полимеразы.
Таблица 2 - Рекомендуемый состав амплификационной смеси (корректируется в соответствии с инструкцией производителя фермента) на 10 проб при объеме пробы 25 мкл*
Реактивы с указанием концентрации | Количество добавляемого реактива, мкл | |
на одну пробу | на 10 проб | |
1 Деионизированная вода | Не более 20 (необходимо учитывать объем ДНК-матрицы**), в данном случае 14,5 | 145 |
2 Буфер для ПЦР с  (10 ) | 2,5 | 25,0 |
3 Смесь дезоксинуклеотидов | 0,5 | 50,0 |
4 Праймер 1 (10 мкм) | 1,0 | 30,0 |
5 Праймер 2 (10 мкм) | 1,0 | 30,0 |
6 Taq-полимераза (5 ед/мкл) | 0,5 | 18,0 |
* При использовании флуоресцентной детекции в реакционную смесь добавляют флуоресцентный интеркалирующий краситель для нуклеиновых кислот (типа Sybr Green, Eva green и др.) согласно протоколу производителя. ** По данной таблице предполагается добавление 5 мкл ДНК в пробу. | ||
Таблица 3 - Специфические олигонуклеотиды для идентификации
Наименование олигонуклеотидов | Нуклеотидная последовательность |
Криптоспоридии 1 | GAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGG |
Криптоспоридии 2 | CTGCTTTAAGCACTCTAATTTTCTCAAAG |
Лямблии 1 | CATGCATGCCCGCTCA |
Лямблии 2 | AGCGGTGTCCGGCTAGC |
В каждую пробирку добавляют также анализируемые и контрольные образцы (в объеме желательно не менее 2-5 мкл). Контрольные образцы включают в себя: положительный контроль - к реакционной смеси добавляют ДНК анализируемого возбудителя в определенной концентрации (эталонный образец); отрицательный контроль - к реакционной смеси вместо ДНК добавляют деионизованную воду, заведомо чистую от ДНК возбудителя.
После перемешивания на встряхивателе и сгона капель на дно в центрифуге пробирки помещают в термоциклер. Если используется термоциклер без подогрева крышки, в реакционные пробирки добавляют от 10 до 20 мкл минерального масла для того, чтобы предотвратить испарение проб при нагревании.
14.3.2 Режим ПЦР
Режимы ПЦР могут быть изменены в соответствии с инструкциями производителей, используемых реактивов и аппаратуры (термоциклеров).
Для реакции определения криптоспоридии предусмотрен нижеприведенный протокол.
Начальная денатурация при температуре 95°C 10 мин, далее 55 циклов амплификации (95°C в течение 15 с, 60°C в течение 60 с).
Для реакции определения лямблий предусмотрен следующий протокол.
Начальная денатурация 95°C 5 мин, далее 40 циклов амплификации (95°C в течение 20 с, 53°C в течение 20 с, 72°C в течение 20 с).
Примечание - При применении детекции продуктов реакции в режиме реального времени при задании программы условий амплификации добавляется режим детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с инструкцией к используемым реагентам с применением рекомендованных каналов для флюорофоров.
14.4 Детектирование результатов ПЦР
14.4.1 Флуоресценция
Анализ результатов с детекцией в режиме реального времени проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для выполнения данного вида ПЦР. Согласно инструкции производителя прибора устанавливают все необходимые настройки параметров с учетом указаний для конкретного набора реагентов. Ключевым параметром является значение порогового цикла Ct, т.е. номера цикла, в котором кривая флуоресценции пересекает установленную на соответствующем уровне пороговую линию.
14.4.2 Гель-электрофорез
Методика детекции результатов ПЦР при помощи электрофореза в агарозном геле описана в ГОСТ Р ИСО 21571-2018 (В.2).
14.5 Интерпретация результатов ПЦР
14.5.1 Тестирование считают прошедшим корректно в том случае, если:
а) в пробе с положительным контролем присутствует продукт ожидаемого размера (для детекции методом электрофореза) или значение Ct соответствует ожидаемому, как правило, обозначенному в инструкции к используемым реактивам (для детекции в режиме реального времени);
б) в пробе с отрицательным контролем отсутствуют продукты реакции (для детекции методом электрофореза) или значение Ct отсутствует (или соответствует указанному в инструкции к используемым реактивам) для детекции в режиме реального времени.
Также при оценке корректности прохождения тестирования следует учитывать дополнительные критерии, указываемые в инструкции производителя.
В случае корректно прошедшего тестирования наличие ДНК в анализируемой пробе считают установленным, если на электрофорезном геле присутствует продукт ожидаемого размера (соответствующего положительному контролю) или значение Ct превышает значение в пробе отрицательного контроля.
В случае корректно прошедшего тестирования отсутствие ДНК в анализируемой пробе считают установленным, если на электрофорезном геле в данной пробе отсутствуют продукты реакции или значение Ct равно или меньше значения Ct для пробы с отрицательным контролем (учитывают инструкцию к используемым реактивам).
14.5.2 Если результаты тестирования некорректны, предпринимают следующие действия:
а) в случае некорректных результатов для положительного контроля необходимо повторить ПЦР-тестирование и детекцию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК анализируемого возбудителя;
б) в случае неверных результатов для отрицательного контроля, тестирование повторяют для всех анализируемых проб, начиная с выделения ДНК;
в) если результаты анализа не удовлетворяют критериям, указанным в инструкции производителя прибора или набора реактивов, поступают согласно инструкции производителя прибора или набора реактивов;
г) в случае сомнительности результатов для отдельных проб (например, значение Ct выше, чем допустимо для отрицательного контроля, но ниже, чем минимально требуемое для признания образца положительным) тестирование повторяют для конкретных образцов, начиная с выделения ДНК.
Приложение А
(рекомендуемое)
Схема посева воды из различных объектов
В таблицах А.1, А.2 представлены схемы посева воды из различных объектов при работе различными методами.
Таблица А.1 - Схема посева воды из различных объектов при работе методом мембранной фильтрации
Объект исследования | Объем засеваемой воды, см , для определения |
Водоемы, не загрязняемые сточными водами | 100; 50; 10; 1 |
Водоемы, загрязняемые сточными водами | 10; 1; 0,1; 0,01 |
Водоемы в зоне влияния выпуска сточных вод | 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 |
Таблица А.2 - Схема посева воды из различных объектов при работе титрационным методом
Объект исследования | Объем засеваемой воды, в см , для определения |
Водоемы, не загрязняемые сточными водами | Три повторности: по 10; 1; 0,1 |
Водоемы, загрязняемые сточными водами | Три повторности: по 1; 0,1; 0,01 |
Водоемы в зоне влияния выпусков сточных вод | Три повторности: по 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001; 0,00001 |
Приложение Б
(рекомендуемое)
Определение наиболее вероятного числа бактерий при титрационном методе посева
Число положительных результатов | НВЧ бактерий в | Число положительных результатов | НВЧ бактерий | ||||
из трех объемов по 1 см | из трех объемов по 0,1 см | из трех объемов по 0,01 см | объеме 100 см | из трех объемов по 1 см | из трех объемов по 0,1 см | из трех объемов по 0,01 см | в объеме 100 см |
0 | 0 | 0 | Менее 30 | 2 | 0 | 0 | 91 |
0 | 0 | 1 | 30 | 2 | 0 | 1 | 140 |
0 | 0 | 2 | -* | 2 | 0 | 2 | -* |
0 | 0 | 3 | -* | 2 | 0 | 3 | -* |
0 | 1 | 0 | 30 | 2 | 1 | 0 | 150 |
0 | 1 | 1 | -* | 2 | 1 | 1 | 200 |
0 | 1 | 2 | -* | 2 | 1 | 2 | -* |
0 | 1 | 3 | -* | 2 | 1 | 3 | -* |
0 | 2 | 0 | -* | 2 | 2 | 0 | 210 |
0 | 2 | 1 | -* | 2 | 2 | 1 | 280 |
0 | 2 | 2 | -* | 2 | 2 | 2 | -* |
0 | 2 | 3 | -* | 2 | 2 | 3 | -* |
0 | 3 | 0 | -* | 2 | 3 | 0 | 290 |
0 | 3 | 1 | -* | 2 | 3 | 1 | -* |
0 | 3 | 2 | -* | 2 | 3 | 2 | -* |
0 | 3 | 3 | -* | 2 | 3 | 3 | -* |
1 | 0 | 0 | 36 | 3 | 0 | 0 | 230 |
1 | 0 | 1 | 72 | 3 | 0 | 1 | 390 |
1 | 0 | 2 | -* | 3 | 0 | 2 | 640 |
1 | 0 | 3 | -* | 3 | 0 | 3 | -* |
1 | 1 | 0 | 73 | 3 | 1 | 0 | 430 |
1 | 1 | 1 | 110 | 3 | 1 | 1 | 750 |
1 | 1 | 2 | -* | 3 | 1 | 2 | 1200 |
1 | 1 | 3 | -* | 3 | 1 | 3 | -* |
1 | 2 | 0 | 110 | 3 | 2 | 0 | 930 |
1 | 2 | 1 | -* | 3 | 2 | 1 | 1500 |
1 | 2 | 2 | -* | 3 | 2 | 2 | 2100 |
1 | 2 | 3 | -* | 3 | 2 | 3 | 2900 |
1 | 3 | 0 | -* | 3 | 3 | 0 | 2400 |
1 | 3 | 1 | -* | 3 | 3 | 1 | 4600 |
1 | 3 | 2 | -* | 3 | 3 | 2 | 11000 |
1 | 3 | 3 | -* | 3 | 3 | 3 | Более 11000 |
* Вероятность ниже допустимого уровня. | |||||||
Примечание - Схему посева, приведенную в таблице 3, используют при необходимости получения более точных результатов.
Приложение В
(рекомендуемое)
Постановка оксидазного теста, определение грам-принадлежности
Оксидазный тест - биохимическая реакция, которая позволяет определить наличие цитохромоксидазы, в присутствии которой микроорганизм, содержащий фермент цитохромоксидазу, становится окисленным окрашенным продуктом.
Для определения цитохромоксидазы могут быть использованы коммерческие тест-системы (СИБ для определения оксидазы или аналогов), тест-полоски, диски и реактивы промышленного производства, зарегистрированные в установленном порядке.
Перед работой качества дисков, растворов, реактивов или тест-системы на оксидазу следует испытывать с применением тест-штаммов, дающих отрицательную оксидазную реакцию (например, E.coli) и положительную оксидазную реакцию (например, P. aeruginosa, P. fluorescens).
В.1 Оксидазный тест с тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлоридом
В качестве реактива для оксидазного теста используют 1%-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид, который готовят перед употреблением.
Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями с питательной среды переносят на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченной реактивом тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлоридом для определения оксидазной активности. Оксидазный тест считают положительным, если в течение 1-4 мин появляется окрашивание колоний в фиолетово-коричневый цвет.
В случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий проводят пересев колоний на подтверждающие среды непосредственно с мембранного фильтра, расположенного на кружке фильтровальной бумаги с реактивом. Время пересева не ограничено.
После появления первых признаков положительного теста (окрашивание колоний в синий цвет), но не позднее чем через 4 мин, мембранный фильтр переносят обратно на питательную среду.
В случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий проводят пересев колоний на подтверждающие среды непосредственно с мембранного фильтра, расположенного на питательной среде.
Посев целесообразно проводить не сразу после определения оксидазной активности, а после выдерживания на питательной среде свыше 5 мин.
В.3 Постановка оксидазного теста способом посева штрихом
Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают двумя-тремя каплями одного из указанных выше реактивов для оксидазного теста. Если используют бумажные индикаторные системы (СИБ), то их смачивают дистиллированной водой.
С мембранных фильтров отбирают по три-четыре изолированные колонии каждого типа из числа характерных колоний и наносят штрихом или бляшкой на подготовленную фильтровальную бумагу с помощью одноразовой петли или стеклянной палочки.
Оксидазный тест считают положительным, если в течение 1 мин появляется окрашивание в сине-фиолетовый цвет. Тест считают отрицательным, если цвет в месте нанесения культуры не изменяется.
При получении нечеткого результата колонии пересевают на питательный агар для получения изолированных колоний, посевы инкубируют при температуре (36±2)°C в течение 24-26 ч, а затем проводят повторное определение оксидазной активности.
В.4 Определение грам-принадлежности
Реактивы для окраски препаратов по Граму
В.4.1 Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
В.4.2 Раствор Люголя готовят следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды. Хранят во флаконе из темного стекла.
В.4.3 Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.
На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды. Вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла.
Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки.
На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на протяжении 0,5-1,0 мин, снимают бумагу и наливают раствор Люголя на протяжении 0,5-1,0 мин, сливают раствор Люголя.
Стекло промывают в этиловом спирте в течение 0,5-1,0 мин, пока не перестанет отходить краситель.
Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение 1-2 мин фуксином Циля, разведенным в соотношении 1:10 дистиллированной водой.
После промывания и просушивания препарата мазок микроскопируют: грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску; грамположительные микроорганизмы окрашиваются в синий цвет.
Отношение бактерий к окраске по методу Грама допускается определять прибором для автоматического окрашивания мазков по Граму Можно использовать промышленные наборы для окраски.
В.5 Тест Грегерсена
Петлю суточной агаровой культуры испытуемого штамма суспендируют на предметном стекле в капле 3%-ного раствора КОН. При положительной реакции, свойственной грам отрицательным микроорганизмам, через несколько секунд жидкость в капле приобретает слизистую консистенцию, и при отрыве петли предметного стекла слизистые нити тянутся на расстояние 0,5-2,0 см. Учет результатов пробы рекомендуется проводить на темном фоне.
Приложение Г
(рекомендуемое)
Растворы и методы приготовления для проведения санитарно-паразитологических методов исследования
Г.1 Реагенты, растворы и методы их приготовления для проведения санитарно-паразитологических методов исследования
Г.1.1 Приготовление смеси Никифорова
Смешивают равные части эфира и спирта этилового технического 96% по ГОСТ 17299-79* или ГОСТ 5962-2013.
Г.1.2 Приготовление основного (маточного) раствора Люголя 5%-ного
Г.1.3 Приготовление 1%-ного раствора Люголя
Г.1.4 Приготовление 50%-ного раствора глицерина
Приложение Д
(рекомендуемое)
Определение наиболее вероятного числа колифагов при титрационном методе посева
Число положительных результатов | НВЧ в 100 см . Вероятность | Нижний предел | Верхний предел | ||
из одного объема по 50 см | из пяти объемов по 10 см | из пяти объемов по 1 см | |||
1 | 4 | 16,1 | 0,4095 | 1,9 | 113,9 |
1 | 3 | 9,3 | 0,3422 | 1,1 | 77,4 |
1 | 2 | 5,6 | 0,3218 | 0,7 | 46,4 |
1 | 1 | 3,2 | 0,3039 | 0,4 | 26,2 |
1 | 0 | 1,4 | 0,2500 | 0,2 | 11,5 |
0 | 5 | 6,9 | 0,0010 | 0,8 | 57,6 |
0 | 4 | 5,1 | 0,0060 | 0,6 | 42,5 |
0 | 3 | 3,6 | 0,0222 | 0,4 | 29,6 |
0 | 2 | 2,2 | 0,0671 | 0,3 | 18,5 |
0 | 1 | 1,1 | 0,1937 | 0,1 | 8,8 |
Приложение Е
(рекомендуемое)
Эмпирическая оценка неопределенности при внедрении метода, связанная с исследованиями проб на наличие санитарно-показательных микроорганизмов в поверхностных и сточных водах
В Российской Федерации эмпирическую оценку неопределенности при внедрении метода можно проводить в соответствии с ГОСТ Р 54502.
Основными источниками неопределенности является отбор проб, первичное разведение, оборудование, культуральная среда, реактивы, компетентность исследователя, время проведения исследования, остаточные случайные погрешности.
Лаборатории при внедрении метода должны подтверждать техническую компетентность путем сличительных испытаний. Стандартное отклонение вопроизводимости может быть оценено по результатам, полученным в условиях внутрилабораторного или межлабораторного эксперимента с целью оценки технической компетентности, что позволит оценить неопределенность результатов в условиях конкретной лаборатории.
Количество выросших колоний x на чашках или в пробирках вычисляют по формуле:
n - степень разведения воды (для меньшего разведения).
Число разведений может быть больше, это зависит от степени загрязнения исследуемой воды.
По каждому образцу необходимо исследовать не менее 10 повторностей образца, выполненных каждым исполнителем, по окончании рассчитывают среднее арифметическое значение результатов параллельных определений.
i - индекс выборки i=1 n (n>10);
n - количество составляющих, используемых при вычислении неопределенности;
iA, iB - результат испытаний i-го объекта обычным методом при сравнении методов A и B;
N - количество результатов выборки N>10 при оценке близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных двумя разными сотрудниками лаборатории, выполняющих внедрение метода в конкретных одинаковых условиях в одной лаборатории.
Так как предполагается, что на чашках Петри или в пробирках количество выросших колоний незначительно, т.е. поддается подсчету, то оно подчиняется закону распределения Пуассона. Случайную погрешность, рассчитанную исходя из распределения Пуассона, учитывают при оценке расширенной неопределенности.
Если результат испытаний выражен в логарифмических единицах, то расширенная неопределенность U с учетом того, что коэффициент охвата равен 2 (что приблизительно соответствует вероятности P=0,95), может быть определена по формуле
Таблица Е.1 - Неопределенность, связанная с исследованиями проб на наличие нормируемых показателей поверхностных и сточных вод
Результаты расчетов, КОЕ/20 см или КОЕ/100 см | Образец 1 | Образец 2 |
СКО воспроизводимости,  (КОЕ/см или см ) | 0,013 | 0,02 |
 (КОЕ/см или см ) | 0,024 | 0,026 |
Расширенная неопределенность U , (КОЕ/см или см ) | 0,055 | 0,065 |
Расширенная неопределенность U, % | 4,6 | 4,8 |
Данные о сходимости методов, описанных в настоящем стандарте, основаны на результатах, полученных в межлабораторных испытаниях.
Абсолютная разность между двумя отдельными результатами испытаний или результатов, полученных при использовании одного и того же метода, на идентичном испытуемом материале, одним и тем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение допустимого промежутка времени, будет превышать предел повторяемости не более чем в 5% случаев. При этом оценивают результаты 10 повторных по степени близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных установленных условиях в одной лаборатории.
Оценку воспроизводимости при оценке неопределенности измерений можно проводить в соответствии со статистическими методами, принятыми в ГОСТ Р ИСО 21748.
Библиография
[1] | МУК 4.2.2316-08 | Методы контроля бактериологических питательных сред |
[2] | СанПиН 3.3686-21 | Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней |
[3] | СанПиН 1.2.3685-21 | Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания |
[4] | Методические рекомендации МР 24 ФЦ/513-2004 | Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромогенных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия). - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004 |
УДК 614.78.628:579.262:006.354 | ОКС 13.060.70 |
Ключевые слова: сточная вода, микроорганизмы, энтерококки, обобщенные колиформные бактерии, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, колифаги, патогенные бактерии рода Shigella и рода Salmonella, цисты лямблий, ооцисты криптоспоридий, яйца и личинки гельминтов | |
