ГОСТ ISO 16649-2-2015
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ И КОРМОВ
Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных (кишечная палочка)
Часть 2
Методика подсчета колоний при температуре 44°С с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of -glucuronidase-positive . Part 2. Colony-count technique at 44°C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl---glucuronide
МКС 67.100.30
Дата введения 2017-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 января 2015 г. N 74-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | Минэкономики Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Молдова | MD | Молдова-Стандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 августа 2016 г. N 955-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16649-2-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16649-2:2001* "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка). Часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44°С с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида" ("Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of -glucuronidase-positive Escherichia coli. Part 2. Colony-count technique at 44°C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide", IDT).
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт . - .
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 9 "Микробиология" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта с целью применения обобщающего понятия в наименовании стандарта в соответствии с ГОСТ 1.5-2001.
В стандарт внесены следующие редакционные изменения: единица измерения миллилитр (мл) заменена на кубический сантиметр (см); 5.2.1 и 5.2.2 дополнены примечаниями.
В разделе "Нормативные ссылки" ссылки на международные стандарты актуализированы.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Введение
Введение
Международный стандарт ISO 16649 состоит из следующих частей под общим наименованием "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка)":
- часть 1. Методика подсчета колоний при температуре 44°С с применением мембран и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;
- часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44°С с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;
- часть 3. Метод наиболее вероятного числа с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида.
В данном стандарте описаны два горизонтальных метода (ISO 16649-1 и ISO 16649-2) для подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка).
Пользователь может выбрать либо ISO 16649-1, либо ISO 16649-2. Каждая часть предназначена для общего применения. Однако необходимо использовать ISO 16649-1 для пищевой продукции, которая может содержать микроорганизмы, подвергшиеся шоковому воздействию.
1 Область применения
В настоящем стандарте приводится горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в продуктах, предназначенных для потребления человеком в пищу, или в продуктах, предназначенных для корма животных. В нем используется методика подсчета колоний при температуре 44°С на плотной питательной среде, содержащей хромогенный компонент для обнаружения фермента бета-глюкуронидазы.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Штаммы Escherichia coli, которые не растут при 44°С, в частности бета-глюкуронидаза-отрицательные, такие как Escherichia coli О 157, не будут обнаружены.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на межгосударственные стандарты*, которые являются обязательными. Для датированных ссылок применяют только указанное издание, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения):
________________
* Таблицу соответствия национальных стандартов международным см. по ссылке. - .
ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятичных разведений)
ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 бета-глюкуронидаза-положительные Escherichia coli (-glucuronidase-positive Escherichia coli): Бактерии, которые при температуре 44°С образуют типичные колонии синего цвета в среде с триптоном, солями желчных кислот и Х-глюкуронидом (ТВХ) в условиях, описанных в настоящем стандарте.
3.2 подсчет бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (enumeration of -glucuronidase-positive Escherichia coli): Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр или грамм образца, когда испытание и вычисления проводятся в соответствии с настоящим стандартом.
4 Сущность метода
4.1 Заданное количество исследуемого образца или исходной суспензии засевают в две параллельные чашки Петри со средой с триптоном, солями желчных кислот и Х-глюкуронидом (ТВХ).
При таких же условиях каждое последующее десятичное разведение образца или исходной суспензии засевают в две чашки Петри со средой ТВХ.
Чашки инкубируют в течение 18-24 ч при температуре (44±1)°С, затем исследуют на наличие колоний, типичных для бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli.
4.2 Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на грамм или кубический сантиметр образца (см. пункт 10).
5 Разбавитель и питательная среда
См. действующую лабораторную практику в ISO 7218.
5.1 Разбавитель
См. ISO 6887-1 или соответствующий стандарт, касающийся подлежащего исследованию продукта.
5.2 Питательная среда: среда с триптоном, солями желчных кислот и Х-глюкуронидом (ТВХ)
5.2.1 Состав
Ферментативный гидролизат казеина | 20,0 г |
Соли желчных кислот N 3 | 1,5 г |
5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновая кислота (ВСIG) | 144 мкмоль |
Диметилсульфоксид (DMSO) | 3 см |
Агар | от 9 до 18 г |
Вода | 1000 см |
Например, 0,075 г соли циклогексиламмония. |
5.2.2 Подготовка
Растворяют ВСIG в диметилсульфоксиде или в рекомендованном изготовителем разбавителе.
Растворяют все компоненты в воде и нагревают до кипения.
При необходимости отрегулировать pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2±0,2) при температуре 25°С.
Производят стерилизацию в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин. Сразу же охлаждают среду в водяной бане (6.3) при температуре от 44°С до 47°С.
6 Оборудование и стеклянная посуда
Обычное микробиологическое лабораторное оборудование (см. ISO 7218):
6.1 Устройство для суховоздушной стерилизации (печь) или паровой стерилизации (автоклав).
6.2 Инкубаторы, способные поддерживать температуру (44±1)°С.
6.3 Водяная баня, способная поддерживать температуру от 44°С до 47°С.
6.4 Пробирки, бутылки или колбы необходимой вместимости.
6.5 Пипетки или микропипетки с одной меткой (выдувные), с широкими отверстиями и номинальной вместимостью 1 и 10 см, с ценой деления 0,1 и 0,5 см соответственно.
6.6 Чашки Петри диаметром приблизительно 90 мм.
6.7 pH-метр, способный проводить измерения с точностью до ±0,1 ед. pH.
Его минимальный порог измерения должен составлять 0,01 ед. pH. pH-метр должен быть оснащен устройством ручного или автоматического выравнивания температуры.
7 Отбор проб
Очень важно, чтобы лаборатория получила, представительную, не поврежденную и не измененную во время транспортировки или хранения, пробу.
Отбор проб не является частью метода, описанного в настоящем стандарте. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.
8 Подготовка анализируемой пробы
Подготовку анализируемой пробы проводят в соответствии со стандартом, подходящим для рассматриваемого продукта. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.
9 Методика
9.1 Исследуемая часть пробы, исходная суспензия и разведения
См. ISO 6887-1 и любой соответствующий стандарт, подходящий для рассматриваемого продукта.
9.2 Посев и инкубация
9.2.1 Используя стерильные пипетки или микропипетки (6.5), внести в стерильную чашку Петри (6.6) 1 см исследуемой пробы (в случае с жидкостью) или 1 см исходного разведения (10) в случае с другими продуктами.
Засевают по две чашки Петри для каждого разведения.
При необходимости повторяют процедуру с последующими десятичными разведениями, используя новую стерильную пипетку для каждого разведения.
9.2.2 Заливают в каждую чашку Петри приблизительно 15 см среды ТВХ (5.2), предварительно охлажденной до температуры от 44°С до 47°С на водяной бане (6.3).
Аккуратно смешивают инокулят со средой и дают застыть, разместив чашки Петри на прохладной горизонтальной поверхности.
Промежуток времени от момента распределения инокулята в чашке и до внесения среды не должен превышать 15 мин.
9.2.3 Переворачивают засеянные чашки (9.2.2) дном вверх и помещают их в инкубатор (6.2), настроенный на температуру (44±1)°С, на 18-24 ч. Общее время инкубации не должно превышать 24 ч.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Если есть предположение о присутствии подвергшихся шоковому воздействию клеток, вначале следует производить инкубацию в течение 4 ч при температуре (37±1)°С, а затем повышать температуру инкубации до (44±1)°С в течение 18-24 ч. Температура инкубации не должна превышать 45°С.
9.3 Подсчет колоний (КОЕ)
После заданного периода инкубации (9.2.3) подсчитывают типичные колонии (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в каждой чашке, содержащей менее 150 типичных колоний (КОЕ) и менее 300 общих (типичных и нетипичных) колоний (КОЕ).
Чашки, не содержащие типичных колоний (КОЕ), должны быть учтены при вычислениях, приведенных в пункте 10.
10 Обработка результатов
10.1 Общие положения
В ходе вычисления, описанного в 10.2, принимаются во внимание случаи, наиболее часто встречающиеся при проведении испытаний в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Могут возникать некоторые особые, маловероятные случаи (например, сильно различающиеся количества колоний КОЕ в двух чашках из одного разведения или пропорции, сильно отличающиеся от пропорции коэффициента разведения в чашках из двух последовательных разведений). В таком случае результаты подсчета должны быть переданы компетентному микробиологу для изучения, толкования и возможного отклонения.
10.2 Подсчет колоний
Для того чтобы результат был достоверным, необходимо подсчитать количество колоний КОЕ по крайней мере в одной чашке, содержащей не менее 15 типичных колоний КОЕ.
Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в исследуемой пробе, на кубический сантиметр или на грамм N как средневзвешенное из двух последовательных разведений, используя следующую формулу:
, (1)
где - сумма типичных колоний КОЕ во всех чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений, из которых хотя бы одна содержит не менее 15 типичных колоний (КОЕ);
n - количество чашек, выбранных для подсчета из первого разведения;
V - объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см;
n - количество чашек, выбранных для подсчета из второго разведения;
d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d=1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
За результат принимают количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), выраженное как целое число, округленное до двух значащих цифр (если ниже 100), или как число между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени.
10.3 Расчет малых количеств
10.3.1 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты) или первым засеянным разведением отсутствуют типичные колонии (КОЕ)] содержится менее 15 типичных колоний КОЕ, рассчитывают количество колоний (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в испытуемой пробе, N, как среднее арифметическое количество колоний в двух параллельных чашках, используя следующую формулу:
, (2)
где - сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках;
V - объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см;
n - количество выбранных для подсчета чашек (n=2 в данном случае);
d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d=1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
Выражают результаты следующим образом:
- рассчитанное количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты): .
10.3.2 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты), или первым засеянным или сохраненным разведением] отсутствуют типичные колонии КОЕ, результаты выражают следующим образом:
- менее 1/d бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d=1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
10.3.3 Если для двух чашек из первого разведения d общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 с видимыми типичными колониями КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии КОЕ, выражают результаты следующим образом:
- менее 1/d и более 1/d бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d и d - коэффициенты разведения, соответствующие первому и второму выбранным разведениям.
10.3.4 Если для двух чашек из первого разведения d общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 без видимых типичных колоний КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии, КОЕ, выражают результаты следующим образом:
- менее 1/d колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения, соответствующий второму разведению.
10.4 Метод подсчета
10.4.1 В случае, когда количество типичных колоний КОЕ превышает 150 для двух чашек из первого разведения d и когда количество типичных колоний КОЕ не превышает 15 для двух чашек из последующего разведения d:
- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d находится в диапазоне от 167 до 150 (верхняя часть доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует использовать метод расчета для общего случая (10.2);
- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d превышает 167 (верхний предел доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует принять во внимание только результат подсчетов разведения d и произвести подсчет малых чисел (10.3).
10.4.2 Если в ходе подсчета типичных колоний КОЕ в каждой чашке из всех засеянных разведений получено число, превышающее 150, результат выражают следующим образом:
- более 150Id колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d - коэффициент разведения последнего засеянного разведения.
10.4.3 Если только в двух чашках из наименьшего разведения (самая высокая концентрация) содержится менее 150 типичных колоний КОЕ, следует рассчитать количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в анализируемой пробе, N', как среднее арифметическое число колоний, подсчитанных в двух чашках, используя следующую формулу:
, (3)
где - сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках, в одной из которых содержится как минимум 15 типичных колоний КОЕ;
V - объем инокулята, примененного в каждой чашке, см;
n - количество сохраненных чашек (n=2 в данном случае);
d - коэффициент разведения, соответствующий сохраненному разведению.
Округлить результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
10.5 Границы доверительного интервала
См. ISO 7218.
11 Протокол испытания
В протоколе испытания необходимо указать:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
- использованный метод отбора проб, если известен;
- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
- все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с деталями касающихся всех особых случаев, которые могли оказать влияние на результат(ы);
- полученный(е) результат(ы), четко указывающий(е) на использованный для его выражения метод;
- окончательный результат с учетом воспроизводимости, если она оценивалась.
Приложение ДА (справочное). Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам
Приложение ДА
(справочное)
Таблица ДА.1
Обозначение ссылочного международного стандарта | Степень | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
ISO 6887-1:1999 | - | * |
ISO 7218:2007 | IDT | ГОСТ ISO 7218-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования к выполнению микробиологических исследований" |
* Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать официальный перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. |
Библиография
[1] | Blazko N. Evaluation of the -glucuronidase substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide in a 24 hour direct plating method for Escherichia coli. J.Food Protection, 51, p.402 |
[2] | Damare J.M., Campbell D.F. and Johnson R.W. Simplified direct plating method for enhanced recovery of Escherichia coli in food. Journal of Food Science, 50, 1985, pp.1736-1737, 1746 |
[3] | Delisle G.L. and Ley A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic -glucuronidase assay. J.Clin. Microbiol., 27, 1989, pp.778-779 |
[4] | Kilian М. and Bulow Р. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathol. Microbiol. Scand., Sect. B, 84, 1976, pp.245-251 |
[5] | Kilian М. and Bulow Р. Rapid identification of Enterobacteriaceae. Use of a -glucuronidase detecting agar medium (PGUA agar) for the identification of Escherichia coli in primary cultures of urine samples. Acta Pathol. Microbiol. Scand., Sect. B, 87, 1979, pp.271-276 |
[6] | Ley A.N., Bowers R.J. and Wolfe S. Indoxyl--D-glucuronide, a novel chromogenic reagent for the specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental sample. Canadian Journal of Microbiology, 34, 1988, pp.690-693 |
[7] | Manafi М. and Kneifel W. A combined chromogenic-fluorogenic medium for the simultaneous detection of total coliforms and E.coli in water. Zentralbl. Hyg., 189, 1989, pp.225-234 |
[8] | Ogden I.D. and Watt A.J. An evaluation off luorogenic and chromogenic assays for the direct enumeration of Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology, 13, 1991, pp.212-215 |
[9] | Restaino L., Frampton E.W. and Lyon R.H. Use of chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide (X-GLUC) for enumeration of Escherichia coli on 24 hours from ground beef. J.Food Protection, 53 (6), 1990, pp.508-510 |
[10] | Watkins W.D., Rippey S.C., Clavet C.R. Kelly-Reitz D.J. and Burkhardt W. Novel compound for identifying Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology, 54, 1988, pp.1874-1875 |
УДК 579.67.087.1:006.35 | МКС 67.100.30 | IDT |
Ключевые слова: микробиология, пищевая продукция, корма, горизонтальный метод |
Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2016