ГОСТ 35067-2024
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
Средства воспроизводства
СПЕРМА КОБЕЛЕЙ
Технические условия
Products for reproduction. Sperm of dogs. Technical requirements
МКС 11.220
Дата введения 2024-05-15
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 марта 2024 г. № 171-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
Армения | AM | ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения |
Беларусь | BY | Госстандарт Республики Беларусь |
Киргизия | KG | Кыргызстандарт |
Россия | RU | Росстандарт |
Таджикистан | TJ | Таджикстандарт |
Узбекистан | UZ | Узстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 апреля 2024 г. № 531-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 35067-2024 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 15 мая 2024 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сперму кобелей свежеполученную неразбавленную, свежеполученную разбавленную и замороженную (далее - сперма), предназначенную для искусственного осеменения сук.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 8.135 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандарт-титры для приготовления буферных растворов - рабочих эталонов pH 2-го и 3-го разрядов. Технические и метрологические характеристики. Методы их определения
_______________
ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.008 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.2.003 Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности
ГОСТ 12.3.002 Система стандартов безопасности труда. Процессы производственные. Общие требования безопасности
ГОСТ 12.4.011 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 177 Водорода перекись. Технические условия
_______________
ГОСТ 1027 Реактивы. Свинец (II) уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1341 Пергамент растительный. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2156 Натрий двууглекислый. Технические условия
ГОСТ 2222 Метанол технический. Технические условия
_______________
ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4014 Красители органические. Нигрозин водорастворимый. Технические условия
ГОСТ 4148 Реактивы. Железо (II) сернокислое 7-водное. Технические условия
ГОСТ 4159 Реактивы. Йод. Технические условия
ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4232 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия
ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4234 Реактивы. Калий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5556 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ 5833 Реактивы. Сахароза. Технические условия
ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6259 Реактивы. Глицерин. Технические условия
ГОСТ 6672 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 6691 Реактивы. Карбамид. Технические условия
_______________
ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9284 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9293 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 9949 Ксилол каменноугольный. Технические условия
ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13037 Вазелин ветеринарный. Технические условия
ГОСТ 13739 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 13805 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16427 Салфетки и отрезы марлевые медицинские. Технические условия
ГОСТ 17206 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 20015 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 20730 Питательные среды. Бульон мясо-пептонный (для ветеринарных целей). Технические условия
ГОСТ 21239 (ИСО 7741-86) Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний
ГОСТ 21241 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22280 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия
ГОСТ 22300 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
ГОСТ 22340 Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22649 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 23683 Парафины нефтяные твердые. Технические условия
ГОСТ 24363 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25706 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования
ГОСТ 27775 Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Термины и определения
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 29230 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33567-2015 Сахар молочный. Технические условия
_______________
ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ ISO 7886-1 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред
ГОСТ ISO/IEC 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 27775, а также следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 бактерии группы кишечной палочки (колиформные бактерии): Неспорообразующие грамотрицательные палочки, ферментирующие с образованием газа лактозу при 37°C и принадлежащие к родам - Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter.
3.1.2 биологическая проба; биопроба: Метод исследования, основанный на заражении лабораторных животных различными способами: подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно и др. с целью идентификации микроорганизмов по вирулентности или воспроизведения и изучения инфекционного процесса и патологоанатомических изменений.
3.1.4 гемолитические свойства: Способность микроорганизмов гемолизировать эритроциты крови.
3.1.5 интактная акросома: Неповрежденный органоид сперматозоида, расположенный в передней части головки.
3.1.6 искусственное осеменение непродуктивных животных: Метод воспроизводства непродуктивных животных, заключающийся во взятии спермы у самцов и введении ее в половые пути самок.
Примечание - Коли-титр выражают также степенью разведения: 1:10=0,1; 1:100=0,01 и т.д.
3.1.9 органолептический анализ: Исследование органолептических характеристик (цвет, внешний вид, консистенция) визуально, при помощи органов чувств (зрения).
3.1.10 освещенность (в данной точке поверхности): Отношение светового потока излучения, падающего на элемент поверхности, содержащий рассматриваемую точку, к площади этого элемента поверхности.
3.1.11 партия: Определенное количество спермодоз, оформленное одним товаросопроводительным документом.
3.1.12 плазмокоагуляция: Способность патогенных микроорганизмов (преимущественно стафилококков) свертывать цитратную плазму крови кролика.
3.1.13 повторяемость (repeatability): Прецизионность в условиях повторяемости.
3.1.14 препуций: Складки кожи, прикрывающие наружный конец (головку) полового члена.
3.1.15 прецизионность (precision): Степень близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных регламентированных условиях.
3.1.16 санитарно-показательные микроорганизмы: Все разновидности бактерий группы кишечных палочек, наличие которых является показателем загрязнения и свидетельствует о нарушении санитарного режима.
3.1.17 спермициты: Вещества, разрушающие сперматозоиды.
3.1.18 спермодоза: Доза спермы, используемой для одного осеменения.
3.1.19 условия обозрения: Условия, в которых проводится визуальное наблюдение, включая: угол наблюдения испытуемого образца, относительное пространственное расположение источника света, испытуемого образца и глаза, фотометрические и спектральные характеристики источника света, фотометрические и спектральные характеристики фона в окрестностях образца.
3.1.20 условия повторяемости [сходимости]: (repeatability conditions): Условия, при которых независимые результаты измерений (или испытаний) получаются одним и тем же методом на идентичных объектах испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени.
3.1.21 чистая культура (pure culture): Культура микроорганизма, которая представляет собой один биологический вид без содержания других форм.
3.1.22 штамм: Чистая культура одного вида микроорганизмов, выделенная из определенного источника, обладающая специфическими физиолого-биохимическими признаками.
3.1.23 электроэякуляция: Метод забора спермы от кобелей с помощью специального прибора - электроэякулятора, воздействующего на нервные волокна тазовой и пояснично-крестцовой областей посредством электрического тока низкого напряжения и малой силы; используется при невозможности получения спермы естественным физиологическим путем.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ГРМ - гидролизат рыбной муки;
ГМФ - гидролизат мяса (говяжьего) ферментативный;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ЕМ - единицы мутности;
МПА - мясо-пептонный агар;
МПБ - мясо-пептонный бульон;
МППА - мясо-печеночный пептонный агар;
ОСО - отраслевой стандартный образец;
ПЖА - полужидкий агар;
ППД - прямолинейно-поступательное движение;
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
4 Технические требования
4.1 Сперма должна соответствовать требованиям настоящего стандарта и [1], должна быть получена от кобелей-производителей, свободных от возбудителей инфекционных болезней в соответствии с требованиями [2], а также требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
4.2 Сперма по органолептическим, физическим, биологическим и морфологическим показателям должна соответствовать требованиям и нормам, указанным в таблице 1.
Таблица 1 - Показатели качества спермы кобелей
Наименование показателя | Характеристика и норма | |
Свежеполученная неразбавленная сперма | Разбавленная и замороженная сперма | |
Консистенция и внешний вид | Водянистая, однородная, без посторонних примесей | Водянистая, однородная, без посторонних примесей |
Цвет | Молочно-белый или белый с сероватым оттенком | Желтый или светло-желтый |
pH | 6,3-6,7 | - |
Объем эякулята, см , в том числе: | 1,2-45,0 | - |
для кобелей массой 1,0-5,0 кг | не менее 1,2 | |
для кобелей массой 5,1-10,0 кг | не менее 2,2 | |
для кобелей массой 10,1-34,0 кг | не менее 2,4 | |
для кобелей массой 35,0-39,0 кг | не менее 3,9 | |
для кобелей массой 40,0-60,0 кг | не менее 4,5 | |
для кобелей массой от 60,0 кг | не менее 5,4 | |
первая фракция, см | 0,1-12,0 | - |
вторая фракция, см | 0,1-3,0 | - |
третья фракция, см | 1,0-30 | - |
Концентрация сперматозоидов в 1 см , млн., не менее: | - | |
для кобелей массой 1,0-5,0 кг | 110 | |
для кобелей массой 5,1-10,0 кг | 180 | |
для кобелей массой 10,1-34,0 кг | 209 | |
для кобелей массой 35,0-39,0 кг | 359 | |
для кобелей массой 40,0-60,0 кг | 210 | |
для кобелей массой от 60,0 кг | 228 | |
Объем дозы для осеменения, см , не менее | - | 0,5 |
Число сперматозоидов в спермодозе, млн., не менее | - | 150 |
Выживаемость сперматозоидов при температуре 37°C, ч | - | Не менее 5 |
Количество сперматозоидов с ППД, %, не менее | 75 | 50 |
Количество сперматозоидов с аномальной морфологией, %, не более | 20 | 20 |
Количество сперматозоидов с интактной акросомой, %, не менее | 80 | 80 |
Сохраненная не более 30 мин с момента получения. После оттаивания. Допускается другой цвет спермы, обусловленный разбавителем. | ||
4.3 Сперма по микробиологическим показателям должна соответствовать нормам, указанным в таблице 2.
Таблица 2
Наименование показателя | Норма | |
Свежеполученная неразбавленная сперма | Разбавленная и замороженная сперма | |
Общее количество непатогенных микробных тел в см , не более | 1000 | 500 |
Коли-титр, см , не более | 0,1 или 0,3 | Св. 0,111 или 0,3 |
Патогенные и условно-патогенные бактерии и грибы | Не допускаются | Не допускаются |
5 Требования безопасности
5.1 Производственный процесс и оборудование должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.2.003, ГОСТ 12.3.002.
5.2 Требования к обучению персонала безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.
5.3 Средства защиты работающих - по ГОСТ 12.4.011, воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005, вентиляция - по ГОСТ 12.4.021, при работе с электрическим оборудованием руководствуются ГОСТ 12.1.019.
5.4 Требования безопасности при работе с химическими реактивами - по ГОСТ 12.1.007.
5.5 Требования биологической безопасности, производственная санитария и санитарно-противоэпидемический режим должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.008.
5.6 Общие требования проведения микробиологических исследований и работы с микроорганизмами 1-2 групп опасности - по ГОСТ ISO 7218 или нормативным правовым актам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
5.7 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO/IEC 17025.
5.8 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ.
5.9 Утилизацию спермы после определения физических, морфологических, биологических свойств производят кипячением в течение 20 мин.
5.10 Обеззараживание спермы после проведения микробиологических исследований, посевов на питательных средах, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят согласно санитарно-эпидемиологическим требованиям, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
6 Правила приемки
6.1 Сперму принимают партиями.
6.2 На каждую партию спермы оформляют товарно-сопроводительный документ, в котором указывают:
- наименование организации (ветеринарная клиника, ветеринарная лечебница, ветеринарный кабинет и т.д., различных организационно-правовых форм и собственности) проводившей отбор проб спермы;
- наименование организации (питомника) и адрес;
- Ф.И.О владельца кобеля-производителя и его адрес;
- наименование продукции [свежеполученная неразбавленная, свежеполученная разбавленная, замороженная сперма кобеля(ей)];
- информацию о кобеле-производителе (порода, кличка, дата рождения, номер клейма, номер свидетельства о происхождении и наименование организации его выдавшей);
- дату взятия спермы;
- дату заморозки;
- форму фасовки (флакон, пайета (соломинка), гранула);
- количество фасовочных единиц;
- наименование организации, проводившей исследования по показателям качества, указанным в 4.2 и 4.3, дату и номер протокола исследований;
- подпись ветеринарного врача, удостоверяющая соответствие спермы требованиям [1];
- обозначение настоящего стандарта.
7 Методы исследований
7.1 Средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, стандартные образцы, посуда, материалы, реактивы и питательные среды:
- анаэростат или эксикатор 2-250 по ГОСТ 25336 со вставкой для эксикатора 1-230 по ГОСТ 9147;
- бактериологическая петля диаметром около 3 мм;
- баня водяная с обогревом, позволяющая поддерживать температуру от 0°C до 100°C с погрешностью ±2°C;
- бокс биологической безопасности для микробиологических исследований;
- бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
- бумага пергаментная по ГОСТ 1341;
- вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556;
- весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г, действительная цена деления шкалы 0,001 г;
- воронка полипропиленовая;
- воронка стеклянная ВФ-100-150 по ГОСТ 25336;
- газогенерирующие пакеты, обеспечивающие микроаэрофильные и анаэробные условия;
- аквадистиллятор по ГОСТ 22340;
- камера Горяева;
- колбы мерные стеклянные 1-100-2, 1-300-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770;
- корнцанг;
- микроскоп биологический различных марок с увеличением 600-1350 раз (окуляр 15х, объектив 8х, 10х, 40х, 90х);
- микроскоп флуоресцентный, оснащенный кубом флуоресцентных фильтров GFP-L ЕХ460-500 DM 505ВА 510 и с окуляром 15х и объективом 20х, 40х, 100х;
- электроплита по ГОСТ 14919;
- ножницы по ГОСТ 21239;
- оптический стандарт мутности бактерийных взвесей (ОСО мутности) 10 ME;
- пинцет анатомический по ГОСТ 21241;
- полоски для определения pH в диапазоне от не менее 5,0 ед. до не более 8,0 ед. с шагом 0,5-1,0 ед. и наличием в цветовой шкале визуальной оценки pH, равной 6,7 и 6,8 ед.;
- посуда лабораторная мерная по ГОСТ 1770;
- пробирки П1 или П2 по ГОСТ 25336;
- pH-метр с диапазоном измерения от 0 до 14 ед., ценой деления 0,1 ед. pH, погрешностью ±0,04 ед. pH;
- салфетки марлевые стерильные и нестерильные по ГОСТ 16427;
- секундомер или таймер;
- смеситель (меланжер) эритроцитарный;
- сосуд Дьюара;
- стандарт-титры для pH-метрии, изготовленные в соответствии с ГОСТ 8.135;
- стекла шлифовальные для приготовления мазков;
- стерилизатор паровой (автоклав) по ГОСТ 22649;
- ступка 3 или ступка 4 по ГОСТ 9147;
- сушильный шкаф, поддерживающий температуру от 120°C до 180°C;
- столик электрообогреваемый к микроскопу, обеспечивающий поддержание температуры спермы 37°C-38°C;
- счетная камера Вольфгюгеля;
- счетчик колоний или лупа по ГОСТ 25706, с увеличением в 2-10 раз;
- термостат, поддерживающий температуру (37±1)°C;
- термостат, поддерживающий температуру (25±1)°C;
- термостат, поддерживающий температуру (44±1)°C;
- холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур 2°C-8°C по ГОСТ 16317;
- центрифуга лабораторная 1000 об./мин;
- чашки Петри ЧБН-1-100 или ЧБН-2-100 по ГОСТ 25336;
- тест-штаммы микроорганизмов Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Campylobacter fetus subsp. fetus, Clostridium perfringens, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Candida albicans;
- мыши белые лабораторные, клинически здоровые, массой 14-16 г;
- свинки морские, клинически здоровые, массой 350-400 г;
- кролики, клинически здоровые, массой 2 кг;
- агар микробиологический по ГОСТ 17206;
- азот жидкий по ГОСТ 9293;
- ацетат свинца по ГОСТ 1027;
- бромтимоловый синий;
- бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
- вазелин по ГОСТ 13037;
- вода водопроводная по ГОСТ 2874;
- вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
- глицерин по ГОСТ 6259;
- глюкоза по ГОСТ 975;
- дифибринированная стерильная кровь барана;
- желатин;
- железо сернокислое ГОСТ 4148, х.ч., ч.д.а.;
- желчь говяжья сухая;
- желчь бычья натуральная стерильная;
- йод металлический по ГОСТ 4159, х.ч.;
- калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.;
- калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4172, х.ч., ч.д.а.;
- калий хлористый по ГОСТ 4234, х.ч.;
- калия гидроокись по ГОСТ 24363, х.ч., ч.д.а.;
- калия теллурит;
- кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.;
- кислота розоловая;
- кристалл- генцианили метилвиолет для микробиологических целей;
- ксилол по ГОСТ 9949;
- лактоза по ГОСТ 33567;
- мальтоза;
- маннит (маннитол);
- масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
- метанол по ГОСТ 2222, марки Б;
- метиленовый синий;
- мочевина по ГОСТ 6691, ч.д.а.;
- набор диагностический индикаторный бумажный для межродовой и видовой дифференциации энтеробактерий, в состав которого входят следующие компоненты:
- диски с сорбитом, инозитом, лизином, орнитином, цитратом натрия, малонатом натрия, для определения галактозидазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы (диски с фенилаланином, диски с хлоридом железа), сероводорода, для реакции Фогеса-Проскауэра;
- полоски для определения оксидазы и индола;
- набор для биохимической идентификации анаэробных бактерий, в состав которого входят следующие компоненты:
- инструкция;
- цветная шкала для учета результатов;
- полиэтиленовые пакетики для инкубации;
- бланки для регистрации результатов;
- суспензионная среда;
- реактив для теста на индол;
- реактив для теста на нитраты;
- парафиновое (вазелиновое) масло, стерильное;
- набор для идентификации анаэробных бактерий, в состав которого входят следующие компоненты:
- стрипы из микролунок, содержащих дегидрированные субстраты (активные ингредиенты) для тестов: L-триптофан, мочевина, D-глюкоза, D-маннит, D-лактоза, D-сахароза, D-мальтоза, салицин, D-ксилоза, L-арабиноза, желатин (бычий), эскулин железа цитрат, глицерин, D-целлобиоза, D-манноза, D-мелецитоза, D-раффиноза, D-сорбит, L-рамноза, D-трегалоза;
- контейнеры для инкубации;
- суспензионная среда;
- бланки для учета результатов;
- инструкция, поставляемая в наборе;
- реактивы и материалы, не включенные в набор:
- стандарт МакФарланда (3 McF);
- реактив для выявления подкисления сред с углеводами;
- реактив для теста на индол;
- реактив для теста на каталазу (3%-ная перекись водорода);
- минеральное масло;
- набор для идентификации бактерий рода Campylobacter, в состав которого входят следующие компоненты:
- стерильный 0,85%-ный раствор натрия хлорида;
- контейнеры для инкубации;
- стандарт МакФарланда (6 McF);
- бланки для учета результатов;
- инструкция, поставляемая в наборе;
- реактивы и материалы, не включенные в набор:
- реактивы для теста на индол;
- реактив для определения гидролиза гиппуровой кислоты;
- реактив для выявления подкисления сред с углеводами;
- минеральное масло;
- набор для биохимической дифференциации энтеробактерий, в состав которого входят следующие компоненты:
- альфа-нафтол;
- пара-диметиламинобензальдегид;
- хлорид железа (3+) гексагидрат;
- калия гидроксид;
- буферный раствор;
- вазелиновое масло;
- таблица биохимических свойств энтеробактерий;
- набор для биохимической идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae, в состав которого входят следующие компоненты:
- реактивы и материалы, не включенные в набор:
- стерильный 0,85%-ный раствор натрия хлорида;
- реактив для выявления ферментации триптофандеаминазы;
- реактивы для теста на индол;
- реактивы для постановки реакции Фогеса-Проскауэра;
- реактив для теста на оксидазу;
- минеральное масло;
- набор для быстрого дифференцированного окрашивания биопрепаратов, в состав которого входят следующие компоненты:
- раствор № 1 (фиксатор);
- раствор № 2 ("розовый");
- раствор № 3 ("синий");
- буферная смесь;
- набор для биохимической идентификации Enterobacteriaceae, в состав которого входят следующие компоненты:
- стерильная пленка (защитная пленка);
- масло вазелиновое стерильное;
- реактив по Эрлиху;
- 10%-ный раствор хлорида железа (III);
- 1%-ный раствор риванола;
- 1%-ный раствор кислоты хлористоводородной;
- натрия гидрокарбонат по ГОСТ 2156, ч.д.а.;
- натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч. или ч.д.а.;
- натрий лимоннокислый 5,5-водный по ГОСТ 22280, ч.д.а.;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, ч.д.а.;
- натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
- нейтральрот;
- нигрозин водорастворимый по ГОСТ 4014;
- парафин по ГОСТ 23683;
- пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
- перекись водорода по ГОСТ 177;
- пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии (ПБДЭ);
- реактив Эрлиха;
- сахароза по ГОСТ 5833;
- спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
- твин-80;
- тест-система для выявления ДНК микроорганизмов рода Mycoplasma в биологическом материале методом ПЦР, в состав которой входят следующие компоненты:
- ПЦР-смесь-1-R;
- ПЦР-смесь-2 blue;
- минеральное масло для ПЦР;
- положительный контрольный образец ДНК Mycoplasma hominis;
- ДНК-буфер;
- отрицательный контрольный образец;
- фенол кристаллический, ч.д.а.;
- фуксин кислый;
- фуксин основной для микробиологических целей;
- фурацилин;
- хлороформ по ГОСТ 20015;
- экстракт дрожжевой;
- эозин водорастворимый;
- эфир по ГОСТ 22300;
- эфир петролейный, ч.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и испытательного оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных.
Допускается использование готовых и сухих питательных сред, предназначенных для указанных целей, а также сред, приготовленных по прописи производителя. Питательные среды должны соответствовать ГОСТ ISO 11133.
Допускается использование оборудования и материалов (чашек Петри, пипеток, пробирок, флаконов, бутылок) однократного применения, аналогичных по техническим характеристикам, которые подходят для использования в микробиологии и не содержат веществ, подавляющих рост микроорганизмов.
7.2 Подготовка к проведению исследований
7.2.1 Приготовление растворов и реактивов
7.2.1.1 Приготовление 3%-ного раствора натрия хлористого
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 30 сут.
7.2.1.2 Приготовление 0,9%-ного раствора натрия хлористого
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 30 сут.
7.2.1.3 Приготовление 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого 5,5-водного
Срок хранения раствора при температуре (37±1)°C не более 1 сут.
7.2.1.4 Приготовление эозин-нигрозиновой краски
Допускается применять растворы без фоновых красок (нигрозина). При этом готовят только 1%-5%-ный раствор эозина на 3%-ном растворе лимоннокислого натрия с pH (7,2±0,1).
7.2.1.5 Приготовление 3%-ного раствора лимоннокислого натрия с pH (7,2±0,1)
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 10 сут.
Для доведения 3%-ного раствора лимоннокислого натрия до pH (7,2±0,1) добавляют 1%-ный раствор лимонной кислоты.
Полученный раствор используют в течение 1 сут.
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 10 сут.
7.2.1.6 Приготовление буферной смеси из набора для быстрого дифференцированного окрашивания биопрепаратов
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 30 сут.
7.2.1.7 Приготовление 1%-ного раствора эозина
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 30 сут.
7.2.1.8 Приготовление смеси этилового спирта с эфиром петролейным
Срок хранения раствора при температуре (20±2)°C не более 30 сут.
7.2.2 Приготовление питательных сред и реактивов для микробиологических исследований
7.2.2.1 Приготовление 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологический раствор)
Готовый раствор хранят при температуре (20±2)°C не более 14 сут.
7.2.2.2 Приготовление мясо-пептонного бульона, мясо-пептонного агара и мясной воды
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре от (5±3)°C не более 3 мес.
Примечание - Вместо указанного мясо-пептонного агара, мясо-пептонного бульона допустимо применение готового сухого питательного агара (ГМФ-агар (бульон), ГРМ-агар (бульон)), из которого готовят питательную среду в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.3 Приготовление мясо-пептонного агара с 1% глюкозы
К мясо-пептонному бульону, приготовленному по 7.2.2.2, добавляют 2% агар-агара, предварительно измельченного, замоченного и хорошо промытого водой. Среду кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют. Агар в горячем состоянии фильтруют через вату, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют в автоклаве при (121±1)°C в течение 10-20 мин. К расплавленному мясо-пептонному агару добавляют стерильный концентрированный (40%-ный и более) раствор глюкозы из расчета ее содержания в мясо-пептонном агаре в количестве 1% и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре (105-110)°C. Готовая среда должна иметь pH 7,0-7,2. Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре от (5±3)°C не более 30 сут.
Примечание - Вместо указанного мясо-пептонного агара допускается применение готового сухого питательного агара (ГМФ-агар, ГРМ-агар), из которого готовят питательную среду в соответствии с указаниями, прилагаемыми к препарату, и добавляют 1% глюкозы.
7.2.2.4 Приготовление мясо-пептонного агара с 5% крови (5%-ный кровяной агар)
К расплавленному стерильному 2,0%-ному мясо-пептонному агару, приготовленному по 7.2.2.2 и охлажденному до 45°C (не выше), соблюдая правила стерильности, прибавляют 5,0% дефибринированной, стерильно взятой крови барана. Приготовленную среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате) слоем в 5 мм, дают застыть, подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
Готовую среду хранят при температуре (5±3)°C не более 2 сут.
Примечание - Вместо указанного мясо-пептонного агара допустимо применение готового сухого питательного агара (ГМФ-агар, ГРМ-агар), из которого готовят питательную среду, к которой добавляют 5% дефибринированной, стерильно взятой крови барана.
Дефибринированную кровь хранят при температуре (5±1)°C в течение 7 сут.
7.2.2.5 Приготовление мясо-пептонного бульона с содержанием 6,5% натрия хлорида (солевой бульон)
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.6 Приготовление среды Булира
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 7 сут.
7.2.2.7 Приготовление среды Эйкмана (глюкозо-пептонная)
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 7 сут.
7.2.2.8 Приготовление среды лактозо-пептонной (типа Эйкмана)
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 7 сут.
7.2.2.9 Приготовление среды Кесслер
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.10 Приготовление бульона МакКонки
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
Приготовление щелочного раствора бромкрезолового пурпурного
7.2.2.11 Приготовление среды Кода (SDS-бульон: питательная среда для выделения и идентификации энтеробактерий сухая)
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 7 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.12 Приготовление среды Эндо
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.13 Приготовление среды Левина
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.14 Агар МакКонки
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.15 Приготовление трехсахарного агара с мочевиной (по Олькеницкому)
Готовую среду до использования хранят в течение 3 сут в темном месте при температуре (20±2)°C или в течение 14 сут при температуре (5±3)°C.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.16 Агар Клиглера
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
Примечание - Готовая к употреблению среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет. При скашивании следует оставлять столбик высотой 2-2,5 см.
7.2.2.17 Цитратный агар Симмонса
Коммерческую сухую среду готовят согласно указаниям на этикетке.
Примечание - Расплавленную среду скашивают без столбика.
7.2.2.18 Приготовление полужидкого агара (ПЖА) для определения подвижности
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.19 Приготовление среды Кларка
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
Примечание - Среду Кларка применяют для постановки реакций с метиловым красным (метилротом) и Фогес-Проскауэра.
7.2.2.20 Приготовление агара с фенилаланином
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.21 Приготовление среды с мочевиной (по Преусу)
Перед употреблением среду скашивают. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.22 ЦПХ-агар
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.23 ХайФлюоро агар
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.24 Приготовление бульона Жиолитти-Кантони
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 7 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке (бульон Жиолитти-Кантони одинарной концентрации).
7.2.2.25 Приготовление стерильного масла вазелинового
Масло вазелиновое до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более трех месяцев.
7.2.2.26 Приготовление агаризованной среды Байрд-Паркер
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.27 Агар Фогеля-Джонсона
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.28 Среда № 10 для идентификации Staphylococcus aureus
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.29 Приготовление желточно-солевого агара
Желточно-солевой агар готовят на основе сухого питательного агара или мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера.
При использовании МПБ к последнему добавляют 2,0% агар-агара и 6,5% хлористого натрия. При использовании бульона Хоттингера с содержанием аминного азота 150,0 мг % для получения солевого агара добавляют 2,0% агар-агара и 6,5% хлористого натрия.
В случае использования сухого питательного агара к последнему добавляют 6,5% хлористого натрия.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 14 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
Приготовление рабочего раствора желтка.
7.2.2.30 Приготовление молочно-солевого агара
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 3 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.31 Приготовление среды Китта - Тароцци
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 90 сут.
Коммерческую сухую среду готовят согласно указаниям на этикетке.
7.2.2.32 Приготовление среды Вильсон-Блера
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 3 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.33 Приготовление кровяного агара по Цейсслеру
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 3 сут.
7.2.2.34 Приготовление молочной среды
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.35 Приготовление среды с углеводами для определения биохимических свойств клостридий
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.36 Приготовление питательного желатина
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
Коммерческую сухую среду готовят согласно указаниям на этикетке.
7.2.2.37 Приготовление ПЖА (кампилобактер)
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.38 Приготовление ПЖА (кампилобактер) с 0,5% агара; ПЖА (кампилобактер) с 3,5% хлористого натрия
Среду готовят по 7.2.2.37, добавляя в ПЖА (кампилобактер) соответствующие количества компонентов.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.39 Приготовление ПЖА (кампилобактер) с 0,02% цистина
К расплавленному ПЖА (кампилобактер) добавляют 0,02% цистина. Среду перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 20 мин.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.40 Приготовление ПЖА (кампилобактер) с 4% желчи
К расплавленному ПЖА (кампилобактер) добавляют 4,0% стерильной бычьей желчи. Среду перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют при (112±1)°C 20 мин или текучим паром три дня подряд по 20 мин.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.41 Приготовление ПЖА (кампилобактер) с 1% глицина
К расплавленному ПЖА (кампилобактер) добавляют 1,0% глицина. Среду перемешивают, разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром три дня подряд по 20 мин.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.2.42 Приготовление индикаторных полосок с ацетатом свинца для определения продукции сероводорода микроорганизмами
7.2.2.43 Приготовление МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 3 сут.
Перед использованием среду подсушивают в термостате.
7.2.2.44 Приготовление селективного бульона Болтона
Коммерческую сухую среду со специальными добавками готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.45 Приготовление агара Престон
Коммерческую сухую среду со специальными добавками готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.2.46 Приготовление раствора с объемной долей перекиси водорода 3%
Срок годности - не более 7 сут.
7.2.2.47 Приготовление реактива Эрлиха
Реактив хранят в закрытом темном флаконе с притертой пробкой при температуре (5±1)°C не более 30 сут.
Коммерческий реактив подготавливают и используют согласно указаниям на этикетке.
7.2.2.48 Приготовление индикатора метилрот
Реактив хранят в закрытом темном флаконе с притертой пробкой при температуре (5±1)°C не более 30 сут.
Коммерческий реактив подготавливают и используют согласно указаниям на этикетке.
7.2.2.49 Приготовление реактивов для реакции Фогес-Проскауэра
Реактивы хранят в закрытых темных флаконах с притертой пробкой при температуре (5±1)°C не более 30 сут.
Коммерческие реактивы подготавливают и используют согласно указаниям на этикетке.
7.2.2.50 Приготовление растворов и реактивов для окраски по Граму
Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла.
Приготовление водно-спиртового раствора фуксина.
Срок годности - 1 сут.
Приготовление карболового кристаллического фиолетового, генциан-фиолетового или метилового фиолетового для окраски по Граму.
Хранят в темном прохладном месте. Срок годности - до 2 месяцев.
Приготовление раствора Люголя.
Примечание - Можно использовать коммерческие наборы для окраски мазков по Граму.
7.2.3 Приготовление питательных сред для микологических исследований
7.2.3.1 Приготовление суслового агара
Неохмеленное пивное сусло (промежуточный продукт производства пива), содержащее 12,0%-14,0% сахаров, фильтруют через тонкий слой ваты или 3-4 слоя марли, разбавляют водой в соотношении 1:2 или 1:3 до 3°-7° по ареометру Баллинга, затем добавляют 2,0% агар-агара, устанавливают pH 6,0-6,8. Среду стерилизуют при (112±1)°C в течение 10-20 мин.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.3.2 Приготовление кукурузного агара
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.3.3 Приготовление пептонной воды с углеводами
В дистиллированную воду добавляют 1,0% пептона, 0,5% поваренной соли и две-три капли 0,05%-ного раствора бромтимолового синего.
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.3.4 Приготовление среды Сабуро
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.3.5 Приготовление среды Пагано-Левин-Трейо
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 30 сут.
7.2.3.6 Приготовление агара Литмана
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.7 CHROMagar Candida
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.8 Приготовление среды Чапека с агаром
Готовую среду до использования хранят в темном месте при температуре (5±3)°C не более 14 сут.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.9 Солодовый агар
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.10 Микологический агар Киммига
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.11 Агар с бенгальским розовым и хлортетрациклином
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.2.3.12 Агар Чапека с дрожжевым экстрактом
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке.
7.3 Отбор проб
7.3.1 Отбор проб свежеполученной неразбавленной и разбавленной спермы
Сперму от кобелей-производителей берут не ранее, чем через два-три дня после последнего ее получения.
Свежеполученную неразбавленную сперму получают от кобелей-производителей методом мастурбации, с помощью искусственной вагины или методом электроэякуляции.
Искусственную вагину, спермоприемники, воронки, пробирки перед их применением стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°C 30 мин или кипячением в стерилизаторе с дистиллированной водой в течение 20-30 мин. Внутреннюю поверхность искусственной вагины смазывают стерильным, безвредным для сперматозоидов вазелином по 7.2.2.25 или стерильной средой для разбавления спермы. Температура в искусственной вагине перед получением спермы должна быть (35±0,5)°C.
Для взятия спермы не используют хрупкие материалы и спермициды.
Для взятия спермы у кобелей необходимо наличие суки в охоте, влагалищные мазки, взятые у суки в охоте, или искусственные феромоны (метилпарабен, гидроксибензоат).
Сперму кобелей-производителей, предназначенную для анализа, отбирают в специально подготовленном помещении с помощью чистого, стерильного оборудования, с соблюдением правил безопасности [2].
Воздух помещения, в котором проводят отбор проб спермы, обезвреживают с помощью ультрафиолетовых ламп, оборудование и пол увлажняют безвредным для сперматозоидов дезинфектантом или раствором фурацилина. Температура воздуха в помещении должна быть не ниже 18°C.
Перед отбором проб спермы надевают чистую одежду, руки дезинфицируют раствором фурацилина с дистиллированной водой в соотношении 1:5000 или 70%-ным ректификованным спиртом по ГОСТ 5962. Перед взятием спермы у кобеля-производителя наружную поверхность препуция протирают влажной салфеткой по ГОСТ 16427, смоченной в дезинфицирующем растворе (раствор фурацилина с дистиллированной водой в соотношении 1:5000), и насухо вытирают стерильной фильтровальной бумагой по ГОСТ 12026.
Эякулят кобелей-производителей, как правило, отбирают фракционно. Полученную сперму переносят из спермоприемника (воронки) в сухой стерильный флакон (пробирку) и закрывают над пламенем спиртовки резиновой пробкой, обернутой пергаментной бумагой, предварительно простерилизованной вместе с флаконом.
Пробу спермы для анализа отбирают после тщательного перемешивания непосредственно из спермоприемника или из флакона со спермой в стерильной комнате (боксе) стерильной стеклянной пипеткой. Лабораторная посуда, применяемая для отбора проб свежеполученной спермы, должна быть подогрета до температуры (29±1)°C в термостате.
7.3.2 Отбор проб замороженной спермы
7.3.3 Оформление сопроводительных документов
Пробы спермы, направляемые для анализа, сопровождают документом, в котором указывают:
- наименование организации-отправителя (Ф.И.О. владельца кобеля-производителя);
- адрес организации-отправителя (адрес владельца кобеля-производителя);
- наименование материала, направленного в лабораторию (сперма от кобеля-производителя свежеполученная неразбавленная; сперма свежеполученная разбавленная; сперма замороженная);
- фракцию спермы (в случае фракционного отбора);
- в случае направления спермы свежеполученной разбавленной указывают разбавитель;
- количество спермодоз и их объем (для замороженной спермы);
- объем спермы (для свежеполученной неразбавленной спермы и свежеполученной разбавленной спермы);
- количество направляемых проб и их опись;
- дату взятия спермы (год, месяц, число, время);
- краткие сведения о кобеле-производителе: порода, кличка, возраст, клеймо;
- показатели и методы исследования спермы, по которым должны быть получены результаты;
- сведения о результатах клинического осмотра кобеля-производителя и термометрии;
- характер упаковки и способ транспортирования проб;
- время отправления проб в лабораторию (год, месяц, число, время);
- должность и подпись лица, отобравшего пробу для исследования.
7.4 Методы органолептических исследований
7.4.1 Определение цвета
7.4.1.1 Сущность метода
Визуальная оценка цвета в установленных условиях обозрения.
7.4.1.2 Проведение испытания
Цвет спермы определяют визуально при хорошем естественном (рассеянный дневной свет) или искусственном освещении на матовом белом или серовато-белом фоне.
Примечание - Источник освещения, производящий усредненный естественный дневной свет, - люминесцентные лампы "дневного света" с коррелированной цветовой температурой, равной примерно 6500 К, индексом цветопередачи более 90. Для комфортабельного обозрения желательна освещенность на поверхности исследуемого образца спермы в пределах от 1000 лк до 1500 лк.
Сперму помещают в стеклянную посуду (стакан, цилиндр) соответствующего объема по ГОСТ 25336 или ГОСТ 1770. Геометрия проведения визуальной оценки: сперма освещается под углом 45°, луч зрения испытателя перпендикулярен поверхности образца.
7.4.1.3 Обработка результатов
Для описания цвета используют названия цветов, названия оттенков: белый, молочно-белый, желтоватый оттенок и др. Сперма должна соответствовать требованиям, установленным в 4.2
Примечание - При анализе обращают внимание на несвойственные цвета проб спермы, свидетельствующие о наличии примесей крови, гноя, мочи: розовый, красный, желтый, бурый оттенки. Следует учитывать изменения цвета спермы при добавлении в нее разбавителей, что не является отклонением от установленных требований к качеству.
7.4.2 Определение внешнего вида и консистенции
7.4.2.1 Сущность метода
Визуальная оценка консистенции и внешнего вида спермы при покачивании в стеклянной лабораторной посуде.
7.4.2.2 Проведение анализа
Внешний вид и консистенция спермы определяются медленными наклонами стеклянной емкости (стакан, цилиндр) по ГОСТ 25336 или ГОСТ 1770, содержащей исследуемую пробу. По скорости перемещения жидкости по стенкам пробирки определяют консистенцию.
7.4.2.3 Обработка результатов
Для описания консистенции используют термины: жидкая, водянистая, сливкообразная, вязкая, густая и др.
Для описания внешнего вида используют термины: однородная (гомогенная), неоднородная, крошковатая, непрозрачная, прозрачная и др.
Сперма должна соответствовать требованиям, установленным в 4.2.
7.5 Методы исследований физических свойств
7.5.1 Определение объема эякулята
7.5.1.1 Сущность метода
Определение объема прямым измерением с помощью мерной лабораторной посуды.
7.5.1.2 Проведение анализа
7.5.1.3 Обработка результатов
Сперма должна соответствовать требованиям, установленным в 4.2.
7.5.2 Определение объема спермодозы
7.5.2.1 Сущность метода
Определение объема прямым измерением с помощью мерной лабораторной посуды.
7.5.2.2 Подготовка криоконсервированной спермы к исследованию
7.5.2.3 Проведение анализа и обработка результатов
7.5.2.4 Обработка результатов
7.5.3 Определение pH потенциометрическим методом
7.5.3.1 Сущность метода
pH спермы определяют потенциометрическим методом. Сущность метода заключается в измерении электродного потенциала, возникающего при погружении электрода в сперму.
7.5.3.2 Проведение анализа
pH спермы определяют с помощью рН-метра-милливольтметра в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
7.5.3.3 Обработка результатов
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1*. Допускаемые расхождения между результатами двух измерений не должны превышать ±0,1 ед. pH.
Сперма должна соответствовать требованиям, установленным в 4.2.
7.5.4 Определение pH с помощью индикаторной бумаги
7.5.4.1 Сущность метода
Изменение цвета индикатора при взаимодействии с ионами водорода пробы.
7.5.4.2 Проведение анализа
Для проведения анализа каплю спермы с помощью пипетки по ГОСТ 29227 наносят равномерно на рН-бумагу и растирают стеклянной палочкой.
7.5.4.3 Обработка результатов
Результат оценивают через 10-30 с после нанесения спермы на индикаторную бумагу, но не ранее приобретения насыщенного цвета или следуя рекомендациям производителя pH-бумаги. Сравнивают цвет с калибровочной шкалой и определяют pH спермы.
При установлении pH менее 6,0 ед. или более 7,0 ед. необходимо определить pH потенциометрическим методом.
Точность pH-бумаги необходимо проверять на соответствие путем сравнения с показаниями pH-метра не реже одного раза в месяц с использованием стандарт-титра pH-метрии 6,86.
7.5.5 Определение общей концентрации сперматозоидов
7.5.5.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в подсчете сперматозоидов в счетной камере Горяева.
7.5.5.2 Подготовка свежеполученной неразбавленной и разбавленной спермы с помощью меланжера
Сперму тщательно перемешивают и набирают до метки "1" в меланжер, предварительно обработанный смесью спирта и эфира по 7.2.1.8 в соотношении 1:1 и высушенный. Для разбавления спермы и обездвиживания сперматозоидов в меланжер вводят до метки "101" 3%-ный раствор хлористого натрия по 7.2.1.1. Зажав большим и указательным пальцами оба конца наполненного меланжера, тщательно перемешивают содержимое, переворачивая меланжер вверх и вниз не менее 60 раз.
7.5.5.3 Подготовка свежеполученной неразбавленной и разбавленной спермы с помощью автоматических дозаторов
7.5.5.4 Проведение анализа
Аккуратно притирают покровное стекло к камере Горяева, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Удалив из меланжера первые три-четыре капли, кончик меланжера, а при использовании автоматического дозатора - кончик наконечника, обтирают марлевой салфеткой и осторожно наносят одну каплю смеси на край притертого к счетной камере шлифовального покровного стекла. Капля, затекая под стекло, заполняет камеру Горяева. Выдерживают 1-2 мин для прекращения движения клеток (осаждения сперматозоидов). Устанавливают увеличение микроскопа таким образом, чтобы в поле зрения помещалось 16 малых (один большой) квадратов.
Сперматозоиды подсчитывают в 80 малых (пяти больших) квадратах, расположенных по диагонали. Для подсчета сперматозоидов, расположенных в глубине камеры, постоянно вращают микровинт. Положение сперматозоидов внутри или вне квадрата определяют по месту нахождения головки. Головки, расположенные на левой и верхней линиях, относят к тому квадрату, в котором проводят подсчет. Головки можно также учитывать на правой и нижней линиях.
7.5.5.5 Обработка результатов
где n - количество подсчитанных сперматозоидов в 80 маленьких квадратах;
200 - постоянный коэффициент.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1.
7.5.6 Определение концентрации сперматозоидов в спермодозе (в счетной камере)
7.5.6.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в подсчете сперматозоидов в счетной камере Горяева.
7.5.6.2 Подготовка к исследованию
7.5.6.3 Проведение анализа
Анализ проводят по 7.5.5.4.
7.5.6.4 Обработка результатов
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1.
7.6 Методы биологических исследований
7.6.1 Определение выживаемости сперматозоидов при температуре 37°C
7.6.1.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в определении количества сперматозоидов в замороженной сперме, сохранивших ППД после оттаивания и хранения в течение 5 ч в термостате при температуре (37±1)°С.
7.6.1.2 Подготовка к исследованию
Подготовку криоконсервированной спермодозы к исследованию проводят по 7.5.2.2 с тем отличием, что сперму поршнем проталкивают в пробирку, содержащую 2,9%-ный раствор натрия лимоннокислого и находящуюся в термостате.
Пробирки помещают в термостат при температуре (37±1)°C и инкубируют в течение 5 ч.
7.6.1.3 Проведение исследования
После 1, 2 и 5 ч инкубации спермы в термостате при температуре (37±1)°C определяют подвижность сперматозоидов по 7.6.2.
7.6.1.4 Обработка результатов
Сперматозоиды имеют выживаемость не менее 5 ч, если после 5 ч инкубации спермы в термостате при температуре (37±1)°C в ней обнаруживают не менее 1% сперматозоидов с ППД.
7.6.2 Определение количества сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением
7.6.2.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в визуальном определении с помощью микроскопа в раздавленной капле спермы количественного соотношения сперматозоидов с ППД к их общему числу.
7.6.2.2 Подготовка замороженной спермы к исследованию
Подготовка пробы проводится по 7.6.1.2 с тем отличием, что пробирки с разведенной спермой инкубируют при температуре (37±1)°C не более 15 мин.
7.6.2.3 Подготовка свежеполученной и разбавленной спермы к исследованию
Свежеполученную и разбавленную сперму допускается исследовать без разбавления.
7.6.2.4 Проведение исследования
7.6.2.5 Обработка результатов
Результаты анализа представляют в процентах и в количестве сперматозоидов с ППД в дозе, млн/доза.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.
7.7 Методы морфологических исследований
7.7.1 Определение количества сперматозоидов с аномальной морфологией и включений
7.7.1.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом аномальных форм сперматозоидов и включений спермы.
Примечание - К аномальным формам относят сперматозоиды с отклонениями в строении головки (микроскопическая, круглая, несимметричная, укороченная, заостренная, двойная, без мембраны или жгутика), шейки (двойная, ломаная, изогнутая, укороченная), тела (изогнутое, удвоенное, нитевидное, с цитоплазматической капелькой), жгутика (изогнутый, двойной, извитой, скрученный, рудиментарный). К включениям спермы относятся форменные элементы крови, клетки эпителия и т.д.
7.7.1.2 Подготовка замороженной, свежеполученной и разбавленной спермы
7.7.1.3 Проведение исследования
Для окрашивания сперматозоидов применяют 1%-ный раствор эозина по 7.2.1.7.
7.7.1.4 Обработка результатов
Подсчет сперматозоидов и включений проводят не менее чем в трех мазках, суммируя отдельно количество аномальных форм, нормальных сперматозоидов и включений спермы.
где П - количество аномальных форм сперматозоидов, шт.;
Н - количество нормальных форм сперматозоидов, шт.
где В - количество включений спермы, шт.;
П - количество аномальных форм сперматозоидов, шт.;
Н - количество нормальных форм сперматозоидов, шт.
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.
7.7.2 Определение количества мертвых сперматозоидов
7.7.2.1 Сущность метода
Количество мертвых сперматозоидов определяют дифференцированным окрашиванием. Сущность метода заключается в подсчете окрашенных мертвых клеток под микроскопом.
7.7.2.2 Подготовка замороженной, свежеполученной и разбавленной спермы
Пробу спермы подготавливают по 7.6.2.3.
7.7.2.3 Проведение исследования
На чистое, обезжиренное, подогретое до температуры (37±1)°C предметное стекло наносят небольшую каплю неразбавленной или предварительно разбавленной 2,9%-ным раствором лимоннокислого натрия спермы и добавляют две-три капли раствора эозин-нигрозиновой краски по 7.2.1.4, подогретой до температуры 30°C. Сперму и краску смешивают в течение 2-4 с и делают тонкие мазки на трех обезжиренных стеклах.
В каждом препарате подсчитывают по 100-150 сперматозоидов. Отдельно считают количество сперматозоидов с окрашенными и неокрашенными головками. Сперматозоиды с головками, окрашенными частично, относят к мертвым.
7.7.2.4 Обработка результатов
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.
7.7.3 Определение целостности акросомы
7.7.3.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом количества сперматозоидов с интактной акросомой. Целостность акросомы определяют с помощью дифференцированного окрашивания специальными красителями.
7.7.3.2 Подготовка замороженной, свежеполученной и разбавленной спермы
Пробу спермы подготавливают по 7.6.2.3.
7.7.3.3 Приготовление мазка спермы
Предметное стекло перед исследованием тщательно моют и обезжиривают этиловым спиртом.
7.7.3.4 Фиксация мазка
Фиксацию мазка производят фиксирующим раствором (раствор № 1) из набора для быстрого дифференцированного окрашивания биопрепаратов или метанолом.
Мазки спермы погружают в кювет с фиксирующим раствором на 15 мин. По истечении времени пинцетом вынимают стекла из фиксирующего раствора и оставляют на воздухе до полного высыхания.
7.7.3.5 Проведение исследования
В каждом препарате подсчитывают не менее 100 сперматозоидов. Отдельно считают количество сперматозоидов с интактной и с поврежденной акросомой (в том числе сперматозоиды без акросомы).
7.7.3.6 Обработка результатов
За окончательный результат, округленный до третьего десятичного знака, принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1.
7.8 Методы микробиологических исследований
7.8.1 Приготовление разведений
7.8.1.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в приготовлении суспензии с равномерным, насколько это возможно, распределением микроорганизмов, содержащихся в сперме.
Ряд десятикратных разведений готовят с целью сокращения количества микроорганизмов в единице объема, чтобы после инкубации установить наличие роста бактерий или произвести подсчет колоний, как установлено в стандарте.
7.8.1.2 Подготовка проб к исследованиям
Соломинки с помощью корнцанга вынимают из сосуда Дьюара и погружают в водяную баню при температуре (37±1)°C на 10 с, затем вынимают и протирают насухо марлевой салфеткой и обрабатывают ватным тампоном, смоченным 70%-ным спиртом-ректификатом. Стерильным пинцетом придерживают один конец пайеты, а другой конец срезают стерильными ножницами и выливают содержимое в стерильную сухую пробирку.
Колпачки флаконов (пробирок, колбочек) со свежеполученной неразбавленной и свежеполученной разбавленной спермой обрабатывают ватным тампоном, смоченным 70%-ным спиртом-ректификатом.
7.8.1.3 Приготовление разведений
Разведения для посевов готовят следующим образом.
Для оптимальной точности пипетку вводят в эякулят не более чем на 1,0 см. Избегают какого-либо соприкосновения пипетки, содержащей инокулят, со стерильным 0,9%-ным раствором хлористого натрия.
Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку.
При посеве на чашки Петри и в пробирки посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае пользуются одной пипеткой.
Между окончанием приготовления десятикратных разведений и внесением их в питательную среду должно проходить не более 30 мин.
7.8.2.1 Сущность метода
7.8.2.2 Проведение исследования
7.8.2.3 Обработка результатов
Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне. При подсчете пользуются лупой или прибором для счета колоний.
При небольшом количестве выросших колоний подсчитывают их на всей площади чашки. Подсчитанные колонии отмечают на чашке восковым карандашом или чернилами. При сравнительно большом росте микробов дно чашки делят карандашом на секторы (2, 4, 8) и подсчитывают число колоний отдельно в каждом секторе. Полученные числа складывают. При равномерном распределении колоний можно ограничиться подсчетом на 1/2 или 1/4 площади чашки. Полученные числа умножают на 2 или 4 соответственно.
Пример
По результатам подсчета вычисляют среднеарифметическое значение числа колоний из двух посевов одного разведения.
N - количество разведений.
Пример
7.8.3 Определение коли-титра (коли-индекса) спермы
7.8.3.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в сбраживании микробами углеводов - маннита, глюкозы, лактозы (в зависимости от используемой среды), в течение 24 ч инкубации при температуре (43±1)°C, которое сопровождается выделением газа и изменением цвета среды/помутнением.
Количество кишечной палочки, обнаруженной в сперме, выражают в виде коли-титра (титр кишечной палочки) или коли-индекса.
Коли-титр можно перевести в коли-индекс и наоборот. Для перевода коли-титра в коли-индекс единицу делят на объем, выражающий коли-титр. Для перевода коли-индекса в коли-титр необходимо единицу разделить на число, выражающее коли-индекс.
Пример
7.8.3.2 Проведение исследования
Пробирки с посевом выдерживают в термостате при температуре (43±1)°C в течение 18-24 ч. В результате осмотра пробирок устанавливают бродильный титр.
При отсутствии изменения цвета/помутнения среды и газообразования реакцию считают отрицательной. При изменении цвета среды/помутнении и газообразовании (пузырек в газовке) реакцию считают положительной.
При наличии положительной реакции на бродильный титр проводят исследование на идентификацию кишечной палочки. Для этого из пробирок с измененным цветом/помутнением среды и газообразованием производят посев на среду Эндо по 7.2.2.12 с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии.
Перед посевом дно чашки со средой Эндо делят на сектора для каждого разведения. Из каждой пробирки петлей высевают минимальное количество материала на отдельный сектор в виде густо пересекающихся штрихов. Чашки с посевами инкубируют 18-24 ч при температуре (37±1,0)°C.
При отсутствии роста на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки, сперму считают не загрязненной микроорганизмами этого вида.
При появлении на среде Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечной палочки (красных, нередко с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых), а также бесцветных колоний, проводят их изучение.
Из изолированных колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки, приготавливают препараты, которые окрашивают по Граму и микроскопируют.
7.8.3.3 Окраска по методу Грама
При окраске используют растворы красок, приготовленные по 7.2.2.50. На мазок культуры, фиксированной на огне, помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый генцианвиолет. Выдерживают 1-2 мин, после чего снимают фильтровальную бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя. Через 1-2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 20-30 с. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином в течение 1-2 мин. Затем промывают водой, просушивают мазок фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Микробы, окрашенные по Граму в темно-фиолетовый цвет, - грамположительные; микробы, окрашенные в красный цвет, - грамотрицательные.
Кишечная палочка - мелкая грамотрицательная палочка с закругленными концами не образующая спор, может быть биполярно окрашена.
Из колоний, характерных для кишечной палочки ставят вторую бродильную пробу, производя высев в пробирки с одной из сред: Булира, Эйкмана (глюкозо-пептонная среда), типа Эйкмана (лактозо-пептонная среда) по 7.2.2.6-7.2.2.8 с последующим инкубированием при температуре (43±1)°C в течение 18-24 ч. При наличии видимых признаков роста бактерий без газообразования - отрицательный результат. При изменении цвета среды/помутнении и газообразовании (газ в газовке) - результат положительный.
7.8.3.4 Обработка результатов
При посеве в три пробирки со средой, содержащей углеводы из одного и того же разведения спермы, коли-титр устанавливают по таблице 3.
Таблица 3 - Коли-титр при посеве одного и того же разведения спермы
Варианты опыта | Разведение спермы | Коли-титр, см | ||
0,1 | 0,1 | 0,1 | ||
А | - | - | - | Св. 0,3 |
Б | + | - | - | 0,3 |
В | + | + | - | Менее 0,3 |
Г | + | + | + | Менее 0,3 |
Примечание - "+" - кишечная палочка обнаружена; "-" - кишечная палочка не обнаружена. | ||||
При посеве в три пробирки со средой, содержащей углеводы из разных разведений спермы, коли-титр устанавливают по таблице 4.
Таблица 4 - Коли-титр при посеве разных разведений спермы
Варианты опыта | Разведение спермы | Коли-титр, см | ||
0,1 | 0,01 | 0,001 | ||
А | - | - | - | Св. 0,111 |
Б | + | - | - | 0,1 |
В | + | + | - | 0,01 |
Г | + | + | + | Менее 0,001 |
Примечание - "+" - кишечная палочка обнаружена; "-" - кишечная палочка не обнаружена. | ||||
Таблица 5 - Степени чистоты и санитарная оценка качества спермы
Степень чистоты спермы | Количество микробных тел в 1 см | Коли-титр, см | Санитарная оценка качества спермы |
I | - | Св. 0,1 или 0,3 | Стерильна |
II | До 100 | 0,1 или 0,3 | Незначительно загрязнена |
III | До 2000 | 0,1 или 0,3 | Слабо загрязнена |
IV | До 5000 | 0,1 или 0,3 | Средне загрязнена |
V | Более 5000 | 0,01 или менее 0,3 | Сильно загрязнена |
7.8.4 Исследование на наличие колиформных бактерий родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella
7.8.4.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выделении колиформных бактерий с последующим подтверждением по микроскопическим, биохимическим и культуральным признакам принадлежности выделенных типичных колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae, дифференциацией бактерий до рода и вида и определения патогенности выделенных культур в биологической пробе на белых мышах.
7.8.4.2 Проведение исследования
После инкубирования пробирки с посевами просматривают. Отсутствие изменения цвета, помутнения среды и газообразования свидетельствует об отсутствии в пробе спермы колиформных бактерий.
При изменении цвета среды (пожелтение, помутнение) и/или газообразовании (пузырек в газовке) производят посев на одну из дифференциально-диагностических сред для энтеробактерий: Эндо, Левина, Агар МакКонки по 7.2.2.12-7.2.2.1 с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки с посевами инкубируют при температуре (37±1)°C. Через 18-24 ч чашки просматривают и оценивают колонии по характеру роста на принадлежность к родам Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella.
Две-три типичные колонии колиформных бактерий пересевают на скошенный мясо-пептонный агар по 7.2.2.2 и инкубируют при температуре (37±1)°C в течение 18-24 ч.
Из суточных культур бактерий со скошенного агара готовят мазки, окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и микроскопируют. При наличии в мазках из культур однородных мелких грамотрицательных палочек, не образующих спор и капсул, изучают их ферментативные свойства и определяют их подвижность.
Ферментативные свойства изучают у двух-трех агаровых культур бактерий. Для этого агаровые культуры высевают на мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, на комбинированные среды Олькеницкого или Клиглера, цитратный агар Симмонса, ПЖА, среду Кларка по 7.2.2.2, 7.2.2.15-7.2.2.19. Засеянные пробирки инкубируют при температуре (37±1)°C. Ферментативные свойства культур предварительно учитывают через 24 ч, окончательно - через 48 ч. Изучение ферментативных свойств выделенных культур можно проводить также с помощью коммерческих наборов для биохимической идентификации энтеробактерий, согласно инструкциям по применению производителя или нормативным правовым актам, действующим на территории государства, принявшего настоящий стандарт. Родовую и видовую принадлежность культур устанавливают по ферментативным и биохимическим свойствам (см. таблицу 6).
При использовании комбинированной среды Олькеницкого или Клиглера учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов колиформных бактерий в этой среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.
Для определения индола используют 1-2 сут бульонную культуру и реактив Эрлиха по 7.2.2.47 или тест-полоски, пропитанные реактивом Ковача.
Для постановки реакции с метилротом и реакции Фогес-Проскауэра используют культуру, полученную на среде Кларка по 7.2.2.48, 7.2.2.49.
Подвижность колиформных бактерий определяют на среде ПЖА по 7.2.2.18. Диффузный рост после 18-24 ч инкубирования при температуре (37±1)°C свидетельствует о подвижности микроорганизма.
Патогенные свойства определяют у культур бактерий, относящихся к родам Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella в биопробе на белых мышах.
Таблица 6 - Дифференциальные признаки колиформных бактерий по биохимическим свойствам
№ | Тесты | Роды и виды бактерий | ||||||
п/п | Escherichia | Citrobacter | Enterobacter | Klebsiella | ||||
coli | freun- dii | diver- sus | amalo- naticus | aero- genes | cloacae | pneumo- niae | ||
Основные | ||||||||
1 | Глюкоза | + | + | + | + | + | + | + |
2 | Лактоза | + | +/- | +/- | +/- | + | + | + |
3 | Рост на агаре Симонса | - | + | + | +/- | + | + | + |
4 | Образование индола | + | - | + | + | - | - | +/- |
5 | Образование сероводорода | - | + | - | - | - | - | - |
6 | Расщепление мочевины | - | +/- | + | +/- | - | + | + |
Дополнительные | ||||||||
1 | Реакция с метилротом | + | + | + | + | - | - | +/- |
2 | Реакция Фогес-Проскауэра | - | - | - | - | + | + | +/- |
3 | Подвижность | +/- | + | + | + | + | + | - |
Примечание - "+" - ферментация сахара (КГ), образование индола и т.д.; "-" - отсутствие ферментации сахара, образования индола и т.д.; "+/-" - различные показатели у разных штаммов. | ||||||||
Из крови сердца, печени, головного мозга павших белых мышей делают высевы на МПА, МПБ, Эндо, посевы инкубируют при (37±1)°C в течение 18-24 ч. При выделении чистой исходной культуры колиформных бактерий от павших белых мышей биопробу считают положительной.
С целью подбора противомикробных препаратов для санации спермы определяют чувствительность выделенных культур к антибиотикам согласно документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
7.8.4.3 Обработка результатов
При выделении культур колиформных бактерий родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, патогенных для белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной патогенными штаммами заражаемой культуры.
При выделении культур колиформных бактерий родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella не вызывающих гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной непатогенными штаммами колиформных бактерий.
7.8.5 Исследование на наличие бактерий рода Proteus
7.8.5.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в посеве спермы по методу Шукевича, подтверждении принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям рода Proteus с последующей идентификацией бактерий до вида и определении патогенности выделенных культур в биологической пробе на белых мышах.
7.8.5.2 Проведение исследования
С помощью стерильной пипетки одну-две капли исследуемой спермы вносят в конденсационную воду пробирок со свежескошенным питательным агаром по 7.2.2.2, не касаясь поверхности среды. Пробирки с посевами инкубируют при температуре (37±1,0)°C. Предварительный учет результатов проводят через (24±2) ч, окончательный - через (48±2) ч инкубирования. После инкубирования пробирки с посевами просматривают.
Бактерии рода Proteus из конденсационной жидкости растут вверх по всей поверхности среды с образованием ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком.
Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов с характерными культуральными свойствами к бактериям рода Proteus определяют их способность ферментировать глюкозу и сахарозу, дезаминировать фенилаланин, расщеплять мочевину, подвижность, отношение бактерий к окраске по Граму и их морфологию.
Окраска по Граму и микроскопирование.
Из выделенных культур готовят мазки, окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и микроскопируют.
При микроскопировании бактерии рода Proteus представляют собой полиморфные грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул, подвижные (перетрихи).
Для определения ферментации глюкозы, лактозы, образования сероводорода и гидролиза мочевины культуры высевают на скошенный трехсахарный агар с мочевиной (по Олькеницкому) или Агар Клиглера и среду с мочевиной (по Преусу) по 7.2.2.15, 7.2.2.16, 7.2.2.21.
Посевы инкубируют при температуре (37±1,0)°C. Предварительный учет результатов проводят через (24±2) ч, окончательный - через (48±2) ч.
Бактерии рода Proteus ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, лактозоотрицательные, некоторые виды образуют сероводород.
Определение дезаминирования фенилаланина.
Для определения дезаминирования фенилаланина суточную чистую культуру высевают в пробирку со скошенной средой для расщепления фенилаланина по 7.2.2.20. Посевы инкубируют при температуре (37±1,0)°C в течение (48±2) ч. Затем на поверхность агара с выросшей культурой наносят три-пять капель раствора 8-10%-ного раствора треххлорного железа.
Появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о дезаминировании фенилаланина - положительная реакция. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.
Бактерии рода Proteus дезаминируют фенилаланин.
Идентификация бактерий рода Proteus до вида.
Лактозоотрицательные культуры энтеробактерий, дезаминирующие фенилаланин, проявляющие характерные культуральные свойства (ползучий вуалеобразный рост), относят к бактериям рода Proteus и идентифицируют до вида.
Для определения утилизации цитрата суточную чистую культуру высевают в пробирку со скошенной средой Симмонса по 7.2.2.17. Посевы инкубируют при температуре (37±1,0)°C в течение (24±2) ч. Изменение цвета среды после темостатирования указывает на усвоение цитрата - положительная реакция. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.
Для определения индола используют 1-2 сут бульонную культуру и реактив Эрлиха или тест-полоски, пропитанные реактивом Ковача по 7.2.2.47.
В таблице 7 приведены биохимические свойства различных видов бактерий рода Proteus.
Таблица 7 - Биохимические свойства видов бактерий рода Proteus
Вид бактерий | Подвиж- ность | Глюкоза | Лактоза | Фенила- ланин | Серово- дород | Индол | Цитрат |
Proteus vulgaris | + | + | - | + | + | + | + |
Proteus mirabilis | + | + | - | + | + | - | + |
Proteus myxofaciens | + | + | - | + | - | - | + |
Proteus penneri | + | + | - | + | ± | - | - |
Примечание - "+" - ферментация сахара (КГ), образование индола, дезаминирование фенилаланина, утилизации цитрата и т.д.; "-" - отсутствие ферментации сахара, образования индола, утилизации цитрата и т.д.; "±" - различные показатели у разных штаммов. | |||||||
Изучение ферментативных свойств выделенных культур бактерий рода Proteus можно проводить также с помощью коммерческих наборов для биохимической идентификации энтеробактерий, согласно инструкциям по применению производителя или нормативным правовым актам, действующим на территории государства, принявшего настоящий стандарт.
Определение патогенных свойств культур бактерий рода Proteus.
Патогенные свойства определяют у культур бактерий, относящихся к родам Proteus, в биопробе на белых мышах.
Культуру признают патогенной в случае гибели двух и более мышей в течение 3-х сут после заражения. Наблюдение за зараженными белыми мышами продолжают в течение 5 сут.
Из крови сердца, печени, головного мозга павших белых мышей делают высевы на МПА, МПБ, Эндо, посевы инкубируют при (37±1)°C в течение 18-24 ч. При выделении чистой исходной культуры бактерий рода Proteus биопробу считают положительной.
С целью подбора противомикробных препаратов для санации спермы определяют чувствительности выделенных культур к антибиотикам согласно документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
7.8.5.3 Обработка результатов
При выделении культур бактерий рода Proteus, патогенных для белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной патогенными штаммами заражаемой культуры.
При выделении культур бактерий рода Proteus, не вызывающих гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной непатогенными штаммами бактерий рода Proteus.
7.8.6 Исследование на наличие синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa
7.8.6.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выделении культур с последующим подтверждением по микроскопическим, биохимическим и культуральным признакам принадлежности к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa; определении патогенности выделенных культур в биологической пробе на белых мышах.
К бактериям вида Pseudomonas aeruginosa относят аэробные не образующие спор грамотрицательные оксидазоположительные палочки, образующие пигмент пиоционин, вызывающие гемолиз эритроцитов.
7.8.6.2 Проведение исследования
Для выделения синегнойной палочки с помощью стерильной пипетки две-три капли спермы высевают на мясо-пептонный бульон с 1%-2% сахара (глюкозы, лактозы) по 7.2.2.3 и инкубируют посевы в течение 6-7 сут в термостате при температуре (37±1,0)°C, проверяя рост каждые 1-2 сут. О наличии роста синегнойной палочки судят по изменению цвета бульона в зеленовато-голубой.
При наличии роста синегнойной палочки делают пересев с бульона на селективную среду ЦПХ-агар или ХайФлюоро агар по 7.2.2.22, 7.2.2.23 с целью получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при (37±1,0)°C в течение 24 ч (до 48 ч для ХайФлюоро агара).
На ЦПХ-агаре синегнойная палочка образует плоские колонии диаметром от 2 до 3 мм с окрашиванием среды в зеленый или сине-зеленый цвет.
На ХайФлюоро агаре синегнойная палочка при росте на среде разрушает флюорогенный субстрат, освобождая флюороген, который дает видимую флюоресценцию при ультрафиолетовом облучении.
Полученные на ЦПХ-агаре (ХайФлюоро агаре) две-три колонии пересевают на мясо-пептонный агар по 7.2.2.2, мясо-пептонный агар с 5% дифибринированной крови барана по 7.2.2.4, мясо-пептонный бульон.
На мясо-пептонном агаре Pseudomonas aeruginosa дает круглые голубовато-серые колонии. Выделяемый клетками Pseudomonas aeruginosa триметиламин напоминает запах земляничного мыла, что является характерным признаком.
Определение присутствия оксидазы. Платиново-иридиевой петлей или стеклянной палочкой отбирают культуры, выросшие на поверхности мясо-пептонного агара и наносят штрихи на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазы, результат оценивают в течение 5 мин.
Для определения оксидазы допускается использование дисков или растворов отечественного и импортного (зарегистрированных в установленном порядке) промышленного производства. Для контроля качества дисков и растворов применяют музейные оксидазоположительные (Pseudomonas aeruginosa) и оксидазоотрицательные (Escherichia coli) культуры.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa - оксидазоположительные.
На кровяном агаре Pseudomonas aeruginosa вызывает гемолиз эритроцитов.
При росте на мясо-пептонном бульоне Pseudomonas aeruginosa продуцирует водорастворимый пигмент пиоцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-голубой цвет.
Окраска по Граму и микроскопирование.
Из выявленных культур готовят мазки, окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и микроскопируют. При микроскопировании Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные палочки, располагающиеся одиночно, парами или короткими цепочками.
Определение патогенных свойств культур Pseudomonas aeruginosa.
Патогенные свойства определяют у культур Pseudomonas aeruginosa в биопробе на белых мышах.
Культуру признают патогенной в случае гибели двух и более мышей в течение 3-х сут после заражения. Наблюдение за зараженными белыми мышами продолжают в течение 5 сут.
Из крови сердца, печени, головного мозга павших белых мышей делают высевы на МПА, МПБ, посевы инкубируют при (37±1)°C в течение 18-24 ч. При выделении чистой исходной культуры бактерий синегнойной палочки биопробу считают положительной.
С целью подбора противомикробных препаратов для санации спермы определяют чувствительности выделенных культур к антибиотикам согласно документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
7.8.6.3 Обработка результатов
При выделении культур бактерий вида Pseudomonas aeruginosa, патогенных для белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной патогенными штаммами заражаемой культуры.
При выделении культур бактерий вида Pseudomonas aeruginosa, не вызывающих гибель белых мышей при внутрибрюшинном заражении, пробу спермы признают контаминированной непатогенными штаммами бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.
7.8.7 Исследование на наличие золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus)
7.8.7.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в посеве спермы на селективно-диагностические среды, подтверждении по микроскопии, биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к Staphylococcus aureus.
7.8.7.2 Проведение исследования
Предположительное присутствие стафилококков на солевом бульоне определяется по помутнению среды; на бульоне Жиолитти-Кантони по почернению среды (обычно у дна пробирки).
Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркера, Фогеля-Джонсона, Среды № 10 для идентификации Staphylococcus aureus, желточно-солевого агара, молочно-солевого агара по 7.2.2.26-7.2.2.30. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста. Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1,0)°C в течение 24-48 ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний (см. таблицу 8).
Для подтверждения принадлежности выделенных культур стафилококков к виду Staphylococcus aureus у выросших и отобранных микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность образовывать каталазу, способность коагулировать плазму крови кролика, вызывать гемолиз эритроцитов барана на 5%-ном кровяном агаре.
Окраска по Граму и микроскопирование.
Из выявленных культур готовят мазки, окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и микроскопируют
При микроскопировании стафилококки окрашиваются по Граму положительно, имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.
С селективной агаровой среды две-три характерные колонии пересевают на скошенный мясо-пептонный агар, мясо-пептонный агар с 5% дифибринированной крови барана по 7.2.2.2, 7.2.2.4. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37±1,0)°C в течение 18-24 ч.
Таблица 8 - Характеристика роста Staphylococcus aureus на селективно-диагностических средах
Селективная среда | Характеристика колоний Staphylococcus aureus |
Агаризованная среда Байрд-Паркера | Черные блестящие колонии, окруженные прозрачными зонами, размером от 2 до 5 мм |
Агар Фогеля-Джонсона | Колонии черного цвета, окруженные желтой зоной, размером от 1,5 до 3,0 мм |
Среда № 10 для идентификации Staphylococcus aureus | Колонии выпуклые, золотисто-желтого цвета, окруженные желтыми зонами размером от 2,0 до 4,0 мм |
Желточно-солевой агар | Колонии имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды |
Молочно-солевой агар | Слегка выпуклые непрозрачные круглые колонии, окрашенные от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм |
На мясо-пептонном агаре стафилококки образуют непрозрачные, круглые 2-4 мм в диаметре) ровные колонии, окрашенные в цвет липохромного пигмента (кремовый, желтый, оранжевый).
Тест на каталазу.
На предметное стекло наносят одну-две капли 3%-ной перекиси водорода по 7.2.2.46. С мясо-пептонного агара отбирают колонию с помощью стерильной стеклянной или пластиковой палочки (но только не металлической иглой) и осторожно эмульгируют в перекиси. Появление пузырьков сразу же свидетельствует о выделении бактериями каталазы.
Постановка реакции плазмокоагуляции.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на + (один плюс).
Реакцию считают положительной, если:
+ + + + - сгусток плотный;
+ + + - сгусток, имеющий небольшой отсек;
+ + - сгусток в виде взвешенного мешочка.
Все три варианта являются положительным результатом.
Бактерии вида Staphylococcus aureus - коагулазоположительные.
Определение гемолитической активности.
С целью подбора противомикробных препаратов для санации спермы определяют чувствительности выделенных культур к антибиотикам согласно документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
7.8.7.3 Обработка результатов
При выделении культур Staphylococcus aureus пробу спермы признают контаминированной микроорганизмами данного вида.
7.8.8 Исследование на наличие бактерий рода Clostridium
7.8.8.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в посеве спермы в среду Китта-Тароцци с последующей идентификацией выделенных культур по морфологическим, культуральным, биохимическим признакам и патологическим изменениям у зараженных лабораторных животных.
7.8.8.2 Проведение исследования
Для выделения анаэробных бактерий (клостридий) по одной-две капли спермы засевают в две пробирки со средой Китта-Тароцци по 7.2.2.31. Среду Китта-Тароцци предварительно регенерируют прогревом в кипящей водяной бане в течение 30 мин, после чего быстро охлаждают до 45°C-50°C. После посева спермы одну из пробирок выдерживают в водяной бане при температуре 80°C в течение 20 мин для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры.
Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре (37±1,0)°C на 24-48 ч.
При отсутствии роста через 48 ч посевы инкубируют до 10 сут с ежедневным контролем роста.
При обнаружении роста на среде Китта-Тароцци учитывают интенсивность роста, характер осадка, а также наличие и степень газообразования и проводят микроскопическое исследование.
Окраска по Граму и микроскопирование.
Из среды Китта-Тароцци готовят мазки, окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и микроскопируют.
Для обнаружения наличия капсул проводят окраску мазков по Ольту; при микроскопии устанавливают наличие капсул у Clostridium perfringens (в мазках из органов).
При обнаружении в мазке микроорганизмов, сходных по морфологическим свойствам с клостридиями, проверяют их культуральные и биохимические свойства.
Делают посев полученной культуры на кровяной агар Цейсслера, среду Вильсона-Блера (для дифференциации Clostridium perfringens от других клостридий), молоко, желатин; при необходимости делают посевы на среды с углеводами по 7.2.2.32-7.2.2.36. Чашки помещают, не переворачивая в микроанаэростат или эксикатор, из которого удаляют воздух. Чашки и пробирки с посевами выдерживают в термостате при (37±1,0)°C в течение 12-48 ч, после чего просматривают рост в чашках и пробирках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам (см. приложение Б).
Изучение ферментативных свойств выделенных культур бактерий рода Clostridium можно проводить также с помощью коммерческих наборов для биохимической идентификации анаэробных бактерий, согласно инструкциям по применению производителя или нормативным правовым актам, действующих на территории государства, принявшего настоящий стандарт.
Определение патогенных свойств культур анаэробов (клостридий).
При наличии вирулентных штаммов клостридий морские свинки погибают через 16-48 ч (в зависимости от вида возбудителя).
При вскрытии у павших морских свинок обнаруживают патологоанатомические изменения (см. приложение В).
Из трупа морской свинки делают посевы из места введения материала, крови сердца и печени в среду Китта-Тароцци, МПБ и на МПА, мазки-отпечатки из тех же органов, а также с диафрагмальной поверхности печени. При наличии Clostridium septicum в мазках с поверхности печени обнаруживают длинные нити. Clostridium perfringens в мазках из органов имеет капсулу. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при (37±1,0)°C в течение 12-48 ч.
Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 8 сут
7.8.8.3 Обработка результатов
При выделении видов бактерий рода Clostridium пробу спермы признают контаминированной бактериями данного вида.
7.8.9 Исследование на наличие возбудителя кампилобактериоза собак, вызванного Campylobacter fetus subspecies fetus
7.8.9.1 Сущность метода
Сущность метода исследования на наличие возбудителя кампилобактериоза собак, вызванного Campylobacter fetus subspecies fetus, заключается в выделении из спермы чистых культур рода Campylobacter с последующей дифференциацией выделенных штаммов до вида (подвида).
При исследовании на наличие возбудителя кампилобактериоза собак, вызванного Campylobacter fetus subspecies fetus, допускается использовать валидированные методы или нормативные правовые акты, действующие на территории государства, принявшего настоящий стандарт.
Кампилобактерии являются микроаэрофилами - оптимальной газовой средой служит смесь из 5%-7% кислорода, 10% углекислого газа, 83%-85% азота.
Примечание - Необходимые микроарофильные условия достигаются при использовании анаэростата и газогенерирующих пакетов (газпаки) промышленного производства; в качестве альтернативы, можно инкубировать в пробирках с плотно закупоренными резиновыми пробками или запайку ватных пробок парафином.
7.8.9.2 Проведение исследования
Исследуемый эякулят высевают в пять пробирок с ПЖА для выделения кампилобактерии по 7.2.2.37 следующим образом.
Стерильной пастеровской пипеткой отбирают сперму до расширенной части, конец пипетки обжигают и опускают вдоль одной стенки в пробирку с питательной средой до дна, набирают среду, чтобы она соединилась с материалом, и осторожно выдувают. Затем пипетку слегка поднимают, отводят к другой стенке пробирки, набирают среду до расширенной части пипетки и переносят в следующую пробирку. Пробирки после посева запаивают парафином или плотно закрывают резиновыми пробками, или помещают в анаэростат обеспечивая оптимум газовой среды.
Посевы инкубируют при (37±1,0)°C в течение 6-10 сут с просмотром через каждые трое сут.
На ПЖА (кампилобактер) культура бактерий рода Campylobacter растет под поверхностью среды в виде серовато-голубоватого резко ограниченного диска толщиной от 1 до 4 мм.
При наличии роста, характерного для кампилобактерии, проводят микроскопию.
Мазки окрашивают по Граму по 7.8.3.3 и фуксином Циля в разведении 1:5 в течение 1-2 мин.
Кампилобактерии представляют собой тонкие изогнутые палочки в форме запятой, подковы или серпа, нередко имеют форму буквы S или напоминают контуры крыльев летящей чайки; длиной 0,5-5,0 мкм и шириной 0,2-0,8 мкм. Спор и капсул не образуют. Встречаются и спириллообразные и коккообразные формы бактерий, количество которых увеличивается в старых культурах. По Граму кампилобактерии окрашиваются отрицательно.
При обнаружении в мазках посторонненей микрофлоры проводят очистку культур следующими методами:
а) рассев загрязненной культуры на чашки Петри с плотной средой МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана по 7.2.2.43 с последующим отсевом отдельных колоний возбудителя на ПЖА (кампилобактер) в пробирках;
б) посев культуры в пастеровские пипетки под слой полужидкой питательной среды;
в) посев культур на ПЖА (кампилобактер) "с подсосом".
В случае обильного роста посторонней микрофлоры, не позволяющего оценить наличие кампилобактерии, исследование прекращают и повторно запрашивают материал.
При нескольких пересевах на ПЖА (кампилобактер) отдельные культуры могут диссоциировать. Такие культуры перед типированием необходимо пересевать на МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана для отбора неизмененных колоний.
Выделенные чистые культуры бактерий подвергаются идентификации по признакам, определяющим род Campylobacter, и дифференцируются до вида (подвида).
Культуры с характерным для кампилобактерии ростом на ПЖА (кампилобактер) и результатом микроскопии пересевают на МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана по 7.2.2.43 и инкубируют при (37±1,0)°C в микроаэрофильных условиях в течении 24-72 ч. На МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана культуры кампилобактерии растут в виде мелких, росинчатых, голубовато-серых колоний или в виде сплошного налета, располагающегося неправильными круглыми или овальными участками, полосами по штрихам посева; не обладают гемолитической активностью.
Типичные колонии проверяют на каталазную активность: материал исследуемой 3-суточной агаровой культуры суспендируют на поверхности предметного стекла в капле 3%-ного раствора перекиси водорода по 7.2.2.46; спустя 3-5 с в взвеси каталазапозитивной культуры происходит интенсивное газообразование. В качестве положительного контроля следует использовать суточную культуру Escherichia coli, отрицательного - Enterococcus faecalis.
У выделенных колоний бактерий рода Campylobacter проверяют способность к сероводородо-образованию, устанавливают наличие роста в присутствии 1% глицина (гликокола), 3,5% хлористого натрия, 0,4% желчи, роста при температуре 25°C и 42, характер роста при увеличении процента агара в питательной среде - по 7.2.2.38-7.2.2.41. Для этого с МППА делают пересев характерных для кампилобактерии колоний на ПЖА (кампилобактер) с добавками.
Выделенные бактерии относят к Campylobacter fetus subspecies fetus при наличии культурально-биохимических свойств, представленных в таблице 9.
Таблица 9 - Культурально-биохимические свойства Campylobacter fetus subspecies fetus
Вид и тип | Культурально-биохимические свойства | ||||||||
Каталаза (с 3-сутуточной культурой) | Рост на ПЖА в микроаэро- фильных условиях в течение 24-72 ч при температуре | Образование  на ПЖА при 37 °C в микроаэ- рофиль- ных | Рост на ПЖА при 37°C в микроаэрофильных условиях в течение 24-72 ч | ||||||
25°C | 42°C | условиях в течение 5 сут | с 0,15% агара | с 0,5% агара (уко- лом) | с 0,4% желчи | с 1,0% глицина | с 3,5% NaCI | ||
Campylobacter fetus subspecies fetus | + | + | - | - | Коль- цо под повер- хно- стью | Вверху | + | + | - |
Примечание - "+" - наличие роста или положительная реакция; "-" - отсутствие роста или отрицательная реакция. | |||||||||
Сероводород определяют с помощью фильтровальной бумаги, пропитанной насыщенным раствором основного уксуснокислого свинца по 7.2.2.42. Полоски бумаги помещают в пробирки с засеянной культурой на ПЖА (кампилобактер) на 1-1,5 см от поверхности среды. Результат учитывают ежедневно в течение 5 сут термостатирования. Почернение кончика бумаги - положительная реакция.
Их проверяют на каталазную активность, сероводородообразование, оценивают рост на ПЖА (кампилобактер) в присутствии 1% глицина (гликокола), 3,5% хлористого натра, 0,4% желчи, рост при температуре 25°C и 42°C.
7.8.9.3 Метод выделения и идентификации Campylobacter fetus subspecies fetus с помощью селективных сред
Две-три типичные колонии пересевают на МППА с 10% дефибрированной крови барана по 7.2.2.43, инкубируют при (37±1,0)°C в микроаэрофильных условиях в течение 40-48 ч. Оценивают рост на МППА с добавлением 10% дефибринированной крови барана; исследование морфологических свойств, определение каталазной активности проводят по 7.8.9.2.
Межвидовую дифференциацию проводят с помощью коммерческих наборов для биохимической идентификации бактерий рода Campylobacter, согласно инструкциям по применению производителя или нормативным правовым актам, действующим на территории государства, принявшего настоящий стандарт.
7.8.9.4 Обработка результатов
При выделении культур Campylobacter fetus subspecies fetus пробу спермы признают контаминированной микроорганизмами данного вида.
7.8.10 Исследование на наличие дрожжеподобных микроскопических грибов рода Candida
7.8.10.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в первичном выделении дрожжеподобных микроскопических грибов рода Candida, их идентификации и определении патогенных свойств (для Candida albicans, Candida tropicalis определение патогенных свойств не проводят).
Микологическое исследование спермы на наличие в ней Candida albicans, Candida tropicalis, Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei, Candida guilliermondi, Candida parapsilosis проводят по следующей схеме: первичное выделение грибов, идентификация и определение патогенных свойств (кроме Candida albicans, Candida tropicalis).
7.8.10.2 Проведение исследования
Параллельно ставят контроль загрязненности воздуха методом седиментации, используя одну чашку Петри с питательной средой.
Чашки инкубируют при температуре (37±1)°C до 3 сут.
Выделенную культуру пересевают на бульон Сабуро и культивируют при (37±1)°C в течение 24-48 ч.
Для предварительной дифференциации выделенных дрожжеподобных грибов рода Candida по культуральным признакам используют среды: кукурузный агар, кровяной агар, одну из сред агар Литмана, Пагано-Левин-Трейо с агаром, CHROMagar Candida, агар Сусло по 7.2.3.1, 7.2.3.2, 7.2.3.5-7.2.3.7 с последующей инкубацией при температуре (37±1)°C в течение 24-48 ч. По характеру роста на питательных средах проводят предварительную родовую дифференциацию (см. приложение Г).
Для видовой дифференциации выделенных дрожжеподобных грибов рода Candida по биохимической активности проводят посев на пептонную воду, содержащую 2% углеводов, по 7.2.3.3. Биохимические свойства грибов рода Candida представлены в таблице 10.
Таблица 10 - Биохимические свойства грибов рода Candida
Культура | Углеводы | |||
Глюкоза | Мальтоза | Сахароза | Лактоза | |
Candida albicans | К+/Г+ | К+/Г+ | К+/Г- | К-/Г- |
Candida tropicalis | К+/Г+ | К+/Г+ | К+/Г+ | К-/Г- |
Candida pseudotropicalis | К+/Г+ | К-/Г- | К+/Г+ | К+/Г+ |
Candida krusei | К+/Г+ | К-/Г- | К-/Г- | К-/Г- |
Candida paraicrusei | К+/Г± | К-/Г- | К-/Г- | К-/Г- |
Candida stellatoidea | К+/Г+ | К+/Г+ | К+/Г+ | К-/Г- |
Candida guillermondi | К-/Г- | К-/Г- | К-/Г- | К-/Г- |
Примечание - "К+" - ферментация углевода; "К-" - отсутствие ферментации углевода; "Г+" - образование газа; "Г-" - отсутствие образования газа; "Г±" - результат вариабелен у 50% культур. | ||||
Микроскопическое исследование. Окрашивают препараты простым методом 1%-ным спиртовым раствором метиленового синего 1-3 мин, 1%-ным водным раствором фуксина 0,5-1 мин. Используют также метод окраски по Граму, по Цилю-Нильсену, по Романовскому-Гимзе, окраска препаратов 1%-ным спиртовым раствором генциан фиолетового в течение 2-3 мин (удобно заранее пропитать этим раствором полоски фильтровальной бумаги, которые затем накладывают на препарат в каплю воды). При микроскопическом исследовании выявляют клетки типичной морфологии (овальные, круглые), в некоторых случаях с почкой (всегда одной), псевдомицелий, иногда хламидоспоры.
7.8.10.3 Определение патогенных свойств культур грибов рода Candida
Вирулентные штаммы Candida вызывают гибель кроликов в период от 3 до 10 сут. В этот период у животных наблюдают депрессию, повышение температуры, исхудание, иногда паралич.
На вскрытии обнаруживают поражения прежде всего почек в виде множественных серовато-белых гранулем в корковом слое, а также печени, селезенки, сердца. Если зараженные кролики не гибнут через 10 сут, их убивают и при обнаружении гранулем в почках штамм относят к слабовирулентным (гибель у животных такие штаммы могут вызывать лишь на 20-30 сут после заражения).
В мазках, приготовленных из пораженных очагов павших или убитых животных, обнаруживают дрожжевидные клетки, иногда псевдомицелий.
7.8.10.4 Обработка результатов
При выделении культур Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei, Candida guilliermondi, Candida parapsilosis, пробу спермы признают контаминированной дрожжеподобными микроскопическими грибами. При выделении культур Candida albicans, Candida tropicalis, а также при гибели лабораторных животных, зараженных Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei, Candida guilliermondi, Candida parapsilosis, пробу спермы признают контаминированной вирулентными штаммами дрожжеподобных микроскопических грибов.
7.8.11 Исследование на наличие грибов рода Aspergillus, Absidia, Mucor, Rhizopus
7.8.11.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в первичном выделении грибов, их идентификации и определении патогенных свойств (для Aspergillus fumigatus, Absidia corimbifera, Absidia ramosa определение патогенных свойств не проводят).
Микологическое исследование спермы на наличие в ней грибов Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Absidia corimbifera, Absidia ramosa, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rnizopus cohnii проводят по следующей схеме: первичное выделение грибов, идентификация и определение их патогенных свойств (кроме Aspergillus fumigatus, Absidia corimbifera, Absidia ramosa).
7.8.11.2 Проведение исследования
При посеве спермы проводят контроль зараженности грибами воздуха в боксе, для чего чашку со средой оставляют открытой в течение 3 мин.
Чашки инкубируют при (24±1)°C в течение 8 сут. Рост большинства грибов становится заметным через 3 сут.
Родовую (а иногда и видовую) принадлежность грибов устанавливают в первичном посеве. При росте грибов, относящихся к роду Aspergillus, семейству Mucoracea выделяют чистые культуры для дальнейшей идентификации (установления вида) и, при необходимости, определения патогенных свойств.
С целью определения видовой принадлежности грибов, относящихся к роду Aspergillus, кроме сред Сабуро и Чапека, можно использовать коммерческие хромогенные среды для дифференциации аспергилл.
После окончания культивирования проводят макро- и микроскопическое исследования.
Макроскопическое исследование: при определении признаков грибов рассматривают колонии на месте их роста, учитывают цвет, форму, консистенцию колонии, характер роста, форму растущего края, наличие или отсутствие пигмента, цвет его, степень развития воздушного мицелия.
Родовую и видовую принадлежность выделенных культур грибов определяют по культурально-морфологическим свойствам, характерным для каждого рода (вида) (см. приложение Д).
7.8.11.3 Определение патогенности Aspergillus и Mucoreceae
Для приготовления споровой суспензии Aspergillus fumigatus желательно добавлять небольшое количество (1-2 капли) твина-80 (эфир олеиновой кислоты и сорбита).
Смерть животного обычно наступает через 4-5 сут, иногда значительно позднее. Если в течение 10 сут животное не погибает, его убивают. При патолого-анатомическом вскрытии наиболее тяжелые поражения обнаруживают в легких и почках. Легкие гиперемированы, отечные, с хорошо заметными, особенно на разрезе, множественными серовато-беловатыми небольшими узелками (гранулемами). Почки увеличены, бугристые, гранулемы обычно хорошо заметны.
7.8.11.4 Обработка результатов
При выделении культур Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rnizopus cohnii пробу спермы признают контаминированной грибами.
При выделении культур Aspergillus fumigatus, Absidia corimbifera, Absidia ramose, а также при гибели лабораторных животных, зараженных Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rnizopus cohnii, пробу спермы признают контаминированной вирулентными штаммами грибов.
7.9 Методы молекулярно-генетических исследований. Выявление микроорганизмов рода Mycoplasma
_______________
7.10 Оформление протокола испытания
В протоколе испытания необходимо указать метод испытания и полученные результаты. В нем должны быть также упомянуты все процедуры, не указанные в настоящем стандарте, или рассматриваемые как дополнительные, а также сведения о любых случаях, вероятно повлиявших на результаты.
В протокол испытаний должна быть включена вся информация, необходимая для точной идентификации образца.
8 Транспортирование и хранение
8.1 Сперма свежеполученная неразбавленная
Сперма не подлежит хранению и используется в течение 30 мин после получения.
8.2 Сперма свежеполученная разбавленная
8.2.1 Сперму транспортируют в термоконтейнерах различных типов при температуре от 5°C до 25°C (в зависимости от состава разбавителя).
8.2.2 Сперму хранят при температуре от 5°C до 25°C (в зависимости от состава разбавителя), аккуратно перемешивают плавными покачивающими движениями не менее двух раз в сутки.
8.2.3 Срок хранения спермы от 3 до 10 сут в зависимости от состава разбавителя. Допускается использование разбавителей, соответствующих нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
8.3 Сперма замороженная
8.3.1 Сперму транспортируют всеми видами транспорта в соответствии с правилами перевозок грузов, действующими на данном виде транспорта.
8.3.2 Сперму хранят и транспортируют в сосудах Дьюара различного объема, заполненных жидким азотом по ГОСТ 9293, температурой минус 196°C.
8.3.3 Срок хранения спермы при соблюдении условий хранения неограничен.
Приложение А
(справочное)
Морфологические особенности бактерий рода Clostridium
Таблица А.1
Виды клостридий | Размер палочек (длина ширина) | Морфология микробов | Расположение спор | Наличие капсулы | Подвижность |
Clostridium perfringens | 4-8 0,8-1,5 мкм | Грамположительные толстые палочки со слегка закругленными концами, расположены одиночно | Центральное, субтерминальное; в молодых культурах отсутствуют | + | Неподвижны |
Clostridium histolyticum | 3-5 0,5-0,8 мкм | Грамположительные стройные тонкие палочки с закругленными концами, расположены одиночно, попарно, редко цепочками | Субтерминальное "Игольное ушко" | - | Перитрих |
Clostridium septicum | 2-10 0,8-2,0 мкм | Грамположительные изолированные палочки с закругленными концами, в мазках-отпечатках с серозных оболочек-нитей | Центральное, субтерминальное | - | Перитрих |
Clostridium oedematiens | 5-10 0,8-1,0 мкм | Грамположительные крупные полиморфные палочки с закругленными или обрубленными концами, расположены одиночно, редко попарно или цепочками из трех-четырех члеников | Центральное, субтерминальное | - | Перитрих |
Clostridium sporogenes | 3-7 0,8-1,1 мкм | Грамположительные палочки с закругленными концами, расположены одиночно, иногда цепочками | Центральное, субтерминальное; в молодых культурах почти у всех палочек | - | Перитрих |
Clostridium sordellii | 2-4 1,0-1,5 мкм | Грамположительные крупные полиморфные палочки с закругленными концами, расположены чаще цепочками по два-четыре членика | Центральное, субтерминальное | - | Перитрих |
Приложение Б
(справочное)
Культуральные и биохимические признаки бактерий рода Clostridium
Таблица Б.1
Виды | Рост на среде | Оптимум | Форма колоний на | Рост в молоке | Рост в | Ферментация углеводов | |||||
клостридий | Китта-Тароцци | разря- жения воздуха, мм рт.ст. | кровяном агаре | желатине | Глюкоза | Саха- роза | Маннит | Глице- рин | Маль- тоза | Галак- тоза | |
Clostridium perfringens | Раннее помутнение и бурное интенсивное газообразование через 4-5 ч | 40 | Круглые колонии зеленоватого цвета, гемолиз сильный, грязно-коричневого цвета | Бурное свертывание молока, образование губкообразного сгустка | Медленное разжижение желатина 3-5 сут | + | + | - | +/- | + | + |
Clostridium histolyticum | Интенсивное помутнение без газообразования | 8-15 | Мелкие гладкие колонии (росинки) без гемолиза | Свертывание молока | Сильное помутнение | - | - | - | - | - | - |
Clostridium septicum | Интенсивное помутнение среды, обильное газообразование | 8-15 | Нежные кружевные колонии с зоной гемолиза | Свертывание молока | Медленное разжижение желатина | + | - | - | - | + | + |
Clostridium oedematiens | Нежное помутнение среды, рост более интенсивный внизу, через 18-24 ч бульон просветляется, на дне выпадает хлопьевидный осадок, газообразование слабое | 3-5 | Шероховатые, корневидные, складчатые с изрезанными краями и выпуклым темным центром, гемолиз сильный, прозрачный, но может отсутствовать (II форма) | Свертывание молока | Разжижает на 2-4 сут | + | - | - | - | +/- | - |
Clostridium sordellii | Помутнение более интенсивное внизу, умеренное газообразование; при старении культур - слизистый осадок | 8-15 | Неправильной формы, корневидные, складчатые, с сероватой шероховатой поверхностью и изрезанными краями, гемолиз сильный, но может отсутствовать (II форма) | Свертывание молока | Разжижает | + | - | - | - | + | - |
Clostridium sporogenes | Рост обильный, кусочки печени обволакивают слизистым осадком, верх среды прозрачный, газообразование слабое. Культура издает неприятный гнилостный запах | 15-20 | Вязкие с изрезанными краями, напоминающие корневище, погружены в агар, поверхность матовая с желтоватым центром, зона гемолиза интенсивная, резко ограниченная (VI форма) | Пептонизация | Разжижает | - | - | - | - | - | - |
Приложение В
(справочное)
Патологоанатомические изменения у лабораторных животных, вызванные бактериями рода Clostridium
Таблица В.1
Название возбудителя | Сроки гибели морских свинок, ч | Патологоанатомическая картина у морских свинок, зараженных клостридиями |
Clostridium septicum | 14-28 | Кожа легко отделяется от мышц. Мышцы и подкожная клетчатка светло-красного или розового цвета, в подкожной клетчатке большое количество пузырьков газа. Кишечник вздут, наполнен разжиженными массами, содержащими пузырьки газа, сосуды инъецированы. В грудной полости и сердечной сорочке обнаруживают значительное количество транссудата |
Clostridium oedematiens | 12-36 | На месте инъекции наблюдается желатинозный, студенистый отек от желтоватого до слабо-розового цвета. Мышцы бледные |
Clostridium sordellii | 12-30 | На месте инъекции наблюдается желатинозный, студенистый отек от желтоватого до слабо-розового цвета. Мышцы бледные |
Clostridium perfringens, типы A и D | 36-48 | Кожа на месте инъекции часто отслаивается от мускулатуры, образуя мешок. Мышцы имеют вид вареного мяса, серовато-грязного цвета (более выражено при заражении типом A). Кишечник вздут, сосуды инъецированы |
Clostridium perfringens, типы B и C | 36-48 | Кожа на месте инъекции легко отделяется, но не отслаивается. Мускулатура сухая, красного цвета различных оттенков. Кишечник вздут, геморрагически воспален, иногда образуются язвы (тип B) |
Clostridium histolyticum | 18-48 | При подкожном заражении большей частью наблюдают выздоровление морских свинок. При заражении в мышцу бедра кожа красно-фиолетовая, напряжена, иногда лопается. Мышцы теряют свою структуру, расплавляются и превращаются в кашицеобразную массу с примесью сгустков крови. Мягкие ткани отделяются от костей и сосудов. Газ не образуется, гнилостного распада нет |
Clostridium sordellii | На месте инъекции наблюдается желатинозный студенистый отек от желтоватого до слабо-розового цвета. Мышцы бледные | |
Clostridium sporogenes | Патогенен в ассоциации с другой микрофлорой |
Приложение Г
(справочное)
Культурально-морфологические признаки грибов рода Candida
Таблица Г.1
Наименование вида | Агар Сабуро | Сусловый агар | Кровяной агар | Агар Литмана | CHROM agar Candida | Среда Пагано-Левин-Трейо с агаром | Бульон Сабуро | Кукурузный агар |
Цвет и морфология колоний на питательной среде | Микроскопическое строение | |||||||
Candida albicans | Кремовые, гладкие, влажные, с возрастом морщинистые или с редкими бороздками | Белые, кремовые, мягкие, гладкие, блестящие с ровными краями, глубоко врастают в субстрат, 2-3 см в диаметре | Тускло-серый рост по всей поверхности среды | Конусовидные, блестящие, вначале гладкие; окраска темно-синяя в старых культурах | Зеленый | Кремовые до слаборозовых | Глубинный рост | Псевдомицелий хорошо развит, бластоспоры; хламидоспоры крупные, круглые, двухконтурные, находятся на боковых и концевых точках по краям колонии |
Candida tropicalis | Кремовые, гладкие, влажные, с возрастом морщинистые или с редкими бороздками | Серо-белые, круглые с зубчатыми краями, матовые, слабо врастают в субстрат, 3,5-4,5 см в диаметре | Обильные, серые, окруженные мицелиальной бахромой | Плоские бледно-синие | От темно-синего до сине-серого, темный венчик на агаре | Темно-красные | Небольшая поверхностная пленка, пузырьки пены | Псевдомицелий хорошо развит, ветвистый, бластоспор и псевдоконидии обильные, хламидоспоры отсутствуют |
Candida pseudo-tropicalis | Рост нехарактерный | Серые, матовые, сметано- образной консистенции, слегка приподнятые, 2-3,5 см в диаметре | Мелкие, нехарактерные | Плоские бледно-синие | - | Розовые | Поверхностной пленки нет | Псевдомицелий слабо развит, бластоспор мало, хломидоспоры отсутствуют |
Candida ksrusei | Гладкие, сухие | Белые или серые, гладкие, суховатые, матовые плоские, с неровными выямчатыми краями; врастание в глубь среды отсутствует | Мелкие, различной формы, плоские или высокие | Плоские бледно-синие | Бледно-розовый, пурпурный (шершавая поверхность, широкие белые края) | Белые | Широкая поверхностная пленка | Псевдомицелий хорошо развит, бластоспоры удлиненные, хламидоспоры отсутствуют |
Candida parakrusei | Гладкие | Белые с гладкими краями и поверхностной исчерченностью по периферии, выпуклые; врастание в глубь среды отсутствует; 2-3 см в диаметре | Мелкие, зеленовато-белые | Плоские бледно-синие | - | Бледно-розовые | Поверхностного роста нет | Псевдомицелий хорошо развит, бластоспор мало, хламидоспоры отсутствуют |
Candida stellatoidea | Кремовые, гладкие | Белые, желтоватые, мягкие, сметано- образные, складчатые (звездчатые), борозды довольно глубокие | Звездчатой формы | Наличие отростков, суживающихся к концу | - | Бледно-красные | Поверхностного роста нет | Псевдомицелий хорошо развит, большие шарообразные бластоспоры, хламидоспоры обильные |
Candida guilliermondi | Кремовые | Белые, плоские, влажные, гладкие, с короткими отпрысками в субстрат | Тускло-серый рост по всей поверхности среды | Плоские | Бледно-розовый, пурпурный | Темно-красные | Поверхностного роста нет | Псевдомицелий умеренно развит, бластоспоры мелкие, хламидоспоры отсутствуют |
Candida parapsilosis | - | Белые, кремовые до желтоватых, блестящие, мягкие, гладкие (иногда слабо- складчатые) колонии с ровными краями | - | - | Белый, бледно-розовый | - | - | Псевдомицелий хорошо развит, тонкий и ветвистый, бластоспоры |
Примечание - На кукурузном агаре рост культур при температуре (24±1)°C наблюдается через 24-48 ч. | ||||||||
Приложение Д
(справочное)
Культурально-морфологические свойства грибов отдельных видов
Таблица Д.1
№ п/п | Вид | Культурально-морфологические свойства |
Род Aspergillus Мицелий у видов рода Aspergillus бесцветный или светлоокрашенный, с перегородками, у некоторых видов (Aspergillus flavus, Aspergillus niger) образует шаровидные склероции из толстостенных клеток. Цвет колонии определяется массой конидий, развивающихся на конидиеносцах. Конидиеносцы на концах имеют вздутие (верхушечный пузырь) различной формы, на поверхности которого располагаются цилиндрические клетки-стеригмы в один или два яруса, несущие цепочки конидий. Вздутие конидиеносца, стеригмы и цепочки конидий составляют головку аспергилла. Головка называется радиальной в случае, если стеригмы расположены радиально на поверхности всего вздутия и цепочки конидий радиально расходящиеся. Нерадиальная головка имеет прижатые кверху стеригмы, направленные параллельно оси конидиеносца, и сближенные в плотную колонку цепочки конидий | ||
1 | Aspergillus fumigatus | Колонии широко разрастающиеся, бархатистые, редко пушисто-войлочные от развития воздушного мицелия, сначала голубовато-зеленые, затем зеленые, с возрастом темнеющие. Обратная сторона колонии бесцветная или окрашена в желто-коричневые тона. Конидиеносцы гладкие, короткие, до 300 мкм длиной и 5-8 мкм толщиной, часто более или менее зеленые. Головки нерадиальные - в верхней части колбообразного вздутия до 20-30 мкм в диаметре развиваются одноярусные стеригмы 6-8 (длина) 2-3 (толщина) мкм, расположенные не строго параллельно оси конидиеносца. Конидии шиповатые, округлые, обычно 2,5-3 мкм в диаметре, цепочки их склеены в колонку |
2 | Aspergillus flavus | Колонии широко разрастающиеся, зеленые, часто с оттенком желтой, лимонной окраски, с возрастом обычно темно-желто-зеленые; на обратной стороне бесцветные, или розовато-тускло-желтоватые. Многие штаммы образуют склероции, хорошо видимые невооруженным глазом в виде шаровидных твердых образований, сначала белые, затем коричневые. Конидиеносцы 400-1000 5-15 мкм, с бесцветной шероховатой оболочкой, образуют на верхушке у молодых культур продолговатые, позже полукруглые или круглые вздутия 10-40 мкм в диаметре. Головки радиальные. Стеригмы или одноярусные 10-15 3-5 мкм (главным образом на маленьких вздутиях) или двухъярусные (на больших вздутиях), в последнем случае стеригмы I яруса - 7-10 3-4 мкм, II яруса - 7-10 2,5-3,5 мкм. Конидии яйцевидные или шаровидные, 3-6 мкм в диаметре, от бесцветных до желто-зеленых, иногда почти гладкие, но большей частью с шероховатой оболочкой |
3 | Aspergillus niger | Колонии быстро растущие, бурые, черновато-коричневые или угольно-черные, на обратной стороне бесцветные или желтоватые, иногда образуют твердые белые, с возрастом становящиеся коричневыми, склероции. Конидиеносцы 200-400 7-10 мкм, иногда значительно крупнее, с толстостенной гладкой оболочкой, обычно желтые, а ближе к вершине коричневые. Головки радиальные, крупные. Вздутие шаровидное, 20-50 мкм, иногда до 100 мкм в диаметре, стеригмы одно- и двухъярусные. Стеригмы первого яруса 10-15 6-8 мкм, тесно скученные, второго яруса 6-10 2-3 мкм, более или менее коричневые или почти черные. Конидии иногда гладкие, но чаще шероховатые или шиповатые, коричневые или бурые |
4 | Aspergillus terreus | Колонии широко разрастающиеся, бархатистые, плоские, гладкие, или с неглубокими радиальными бороздами, орехово-бурые, на обратной стороне палевые, желтые или темно-бурые. Конидиеносцы более или менее извилистые, гладкие, бесцветные, 50-150-(250) 5-8 мкм, у вершины с полушаровидным вздутием 10-16 мкм в диаметре. Головки нерадиальные. Стеригмы двухъярусные. Стеригмы первого яруса 7-9 2-2,5 мкм, второго яруса 5-7 2-2,5 мкм. Конидии шаровидные или слегка эллиптические, гладкие, 2,5 2,2 мкм; в цепочках, соединенных в длинную колонку |
5 | Aspergillus versicolor | Колонии медленно растущие, компактные, у некоторых штаммов бархатистые, у других пушистые или же штамм имеет тот и другой признак; вначале белые, затем приобретают желтые оттенки, оранжево-желтые, дымчато-зеленые или телесного цвета; зеленые тона могут отсутствовать. Обратная сторона и субстрат от желтого и оранжевого цвета до розового, пурпурно-красного или красного. Конидиеносцы 500-700 5-10 мкм, с гладкой бесцветной оболочкой. Головки радиальные. Вздутие бутыльчатое или почти шаровидное, 12-20 мкм в диаметре, в верхней, большей своей части, образует радиально расположенные двухъярусные стеригмы, стеригмы первого яруса 3-10 3-5 мкм, второго яруса 5-10 1,5-2 мкм. Конидии шаровидные, обычно слегка шероховатые, 2,5-3 мкм в диаметре, в свободно расходящихся цепочках |
6 | Aspergillus nidulans | Колонии широко разрастающиеся, гладкие, бархатистые, темно-зеленые или желтовато-зеленые на обратной стороне пурпурно-красные, красно-коричневые или с возрастом темно-коричневые. Конидиеносцы более или менее извилистые, гладкие, с коричневой оболочкой, 50-100(200) 3-5 мкм. Головки нерадиальные. Вздутие куполовидное, 7-15 мкм в диаметре; двухъярусные стеригмы покрывают верхнюю часть вздутия, направлены параллельно оси конидиеносца, стеригмы первого яруса 5-8 2-3 мкм, второго - 5-6 2-2,5 мкм. Конидии шаровидные, 3-3,5 мкм в диаметре, гладкие или шероховатые, в массе зеленые, в цепочках, склеенных в колонки. Помимо конидиального имеет сумчатое спороношение, возникшее в результате полового процесса и представленное сумками с аскоспорами, развивающимися внутри плодовых тел - клейстотециев (клейстокарпиев). Клейстотеции шаровидные, 100-200 мкм в диаметре, хорошо различимы невооруженным глазом вначале в центре колонии, затем и по ее периферии, имеют желтоватую или коричневую окраску за счет окружающих их покровных клеток, образованных конечными клетками вегетативных гиф, шаровидных до 25 мкм в диаметре, с очень толстой оболочкой до 4-5 мкм. Стенка клейстотециев тонкая, красноватая. Сумки, заполняющие клейстотеции, многочисленные, состоят из восьми аскоспор. Аскоспоры чечевицеобразные, пурпурно-красные, гладкие, с двумя экваториальными гребешковидными образованиями, 3,8-4,5 3,5-4 мкм |
Семейство Mucoraceae Мицелий хорошо развит, представлен одиночными, разветвленными гифами с далеко отстоящими друг от друга поперечными перегородками или, чаще, без перегородок, главным образом поверхностный. Иногда мицелий прикрепляется к субстрату с помощью корешкообразных разветвленных выростов-ризоидов. В этом случае он часто развивается в виде дугообразно изогнутых воздушных гиф-столонов. Некоторые виды образуют хламидоспоры - клетки с утолщенной оболочкой, одиночные или собранные цепочкой, могут возникать на протяжении гиф (интеркалярные) или на их концах (терминальные). Бесполое воспроизведение мукоровых грибов эндогенное. Органы бесполого размножения представлены спорангиями, развивающимися на концах простых или разветвленных спорангиеносцев и содержащими многочисленные одноклеточные спорангиоспоры. Характерным образованием внутри спорангии является колонка (столбик) шаровидной, грушевидной и др. формы. У некоторых видов спорангиеносец у основания спорангия расширяется в апофизу. Оболочка спорангия или полностью растворяется в воде, или сохраняется у основания колонки в виде воротничка. Половой процесс происходит путем соединения двух специальных клеток (гаметангиев) и образования зигоспоры. Семейство Mucoraceae объединяет 12 родов, среди них Mucor, Rhizopus, Absidia | ||
Род Mucor Спорангиеносцы простые или разветвленные (моноподиально, симподиально, мутовчато), неокрашенные или бледноокрашенные, отходят одиночно от гиф мицелия. Спорангии шаровидные, без апофизы; оболочка растворяется в воде или разрывается и остается у основания колонки в виде воротничка. Столбик различной формы. Ризоиды и столоны обычно отсутствуют | ||
1 | Mucor racemosus | Колонии быстрорастущие, без воздушного вегетативного мицелия, пушистые, 0,8-1,5 см высотой, трудно смачиваемые водой, легко разрывающиеся при незначительном прикосновении. Спорангиеносцы отходят от субстрата, кистевидноразветвленные.до 1,5 см длины и 8-20 мкм толщины. Спорангии шаровидные, 40-100-(140) мкм в диаметре, вначале желтоватые, затем темно-коричневые, просвечивающие. Колонка коричневатая или темно-коричневая, обратно-грушевидная, иногда эллиптически-шаровидная, 20-60-(70) 15-50-(60) мкм. Споры эллиптически-шаровидные, эллиптические, (4)-5-8-(12) 4-6-(8) мкм или шаровидные (4)-5-8-(20) мкм в диаметре, бесцветные, в массе бледно-сероватые. Имеются многочисленные хламидоспоры 10-20 10-15 мкм, одиночные или в коротких цепочках. Ризоиды и столоны отсутствуют |
2 | Mucor pusillus. | Колонии быстрорастущие, 0,2-0,4 см высоты, обычно без воздушного вегетативного мицелия, бархатистые, вначале темно-серые, затем коричневато или рыжевато-темно-серые, с обратной стороны коричневатые. Имеются немногочисленные простые или слабо разветвленные, большей частью неокрашенные ризоиды. Столоны слабо выраженные, также немногочисленные. Споронгиеносцы прямостоящие, отходят от субстрата, прямые, до 0,4 см высоты, 10-25 мкм в диаметре, с (1)2-5(7) мкм короткими веточками в верхней части. Спорангии шаровидные, 20-70(80) мкм в диаметре, вначале неокрашенные, затем серые или свинцово-серые. Колонка яйцевидная или обратно-грушевидная, 20-50 20-45 мкм, коричневато- или серовато-металлического цвета. Споры шаровидные, гладкие, (2,5)-3,5-4,5 (5) мкм в диаметре |
Род Rhizopus. Колонии с развитым воздушным мицелием в виде дугообразно изогнутых столонов, прикрепляющихся к субстрату с помощью ризоидов. Спорангиеносцы темноокрашенные, простые или, реже, разветвленные, отходят пучком по 1-5-(7) мкм от шейки ризоида (т.е. в месте прикрепления столона к субстрату), от столонов или являются продолжением последних. Столоны и ризоиды светлоокрашенные. Спорангии шаровидные или приплюснутые, бурые, черно- или серо-бурые. Колонка светлоокрашенная, от шаровидной до цилиндрической или обратно-грушевидной формы, с воронковидной или блюдцевидной окрашенной апофизой. Споры шаровидные, эллиптические или неправильной формы, часто угловатые и продольно исчерченные. У большинства видов имеются хламидоспоры | ||
1 | Rhizopus nigricans | Колонии быстрорастущие войлочные и рыхловойлочные 1-1,5 см высотой, вначале оливково-зеленые или оливково-темно-зеленые, затем оливково- или буровато-серые, обычно наползающие на боковые стенки и крышку чашки Петри. Столоны хорошо выражены. Розоиды темно-коричневые, разветвленные, хорошо развитые. Спорангиеносцы обычно прямые, неразветвленные, бурые или темно-бурые, 500-3000-(4000) 10-35 мкм; отходят пучком по 2-3-5 мкм, реже I от шейки ризоида. Спорангии (50)-80-250(350) мкм в диаметре, черноватые. Колонка шаровидная или приплюснуто-шаровидная, крупная - (40)-50-120-(150) мкм в диаметре, бледно-бурая. Апофиза блюдцевидная. Споры эллиптически-шаровидные или неправильной формы, сильно угловатые, с продольной исчерченностью, серые или бледно-коричневато-серые, 4-12-(16) 4-10-(12) мкм. Хламидоспоры отсутствуют |
2 | Rhizopus cohnii | Колонии быстрорастущие, рыхловойлочные или пушисто-рыхло-войлочные, со слабо или хорошо развитым воздушным вегетативным мицелием, 0,2-0,6-(1) см высоты, сначала серые или темно-серые, затем становятся свинцово- или синевато-темно-серыми. Ризоиды слабо выражены, неразветвленные или коротко и слабо разветвленные, коричневатые. Столоны слабо выраженные. Спорангиеносцы темно-коричневые или бледно-буроватые, простые или с раздвоенной или мутовчато разветвленной верхушкой, отходят по 1-3-(5) мкм от шейки ризоида или столоновидных гиф; длина их 75-500-(700) мкм, толщина (6)-10-20 мкм. Спорангии 40-120-(140) мкм в диаметре. Колонка чаще эллиптически-цилиндрическая или обратногрушевидная, 20-70-(100) 20-60-(80) мкм, вначале синевато-серая, затем коричневатая. Апофиза блюдцевидная. Споры шаровидные, гладкие, бледно-голубоватые, в массе синевато-черные, 4-6-(7) мкм в диаметре. Имеются довольно многочисленные хламидоспоры |
Род Absidia Колонии с развитым воздушным мицелием, обычно пушистые и светлоокрашенные. Ризоиды обычно имеются, неокрашенные, простые (стержневидные) или разветвленные, столоны выражены в различной степени. Спорангиеносцы простые или с 1-2-(3) боковыми веточками, отходят мутовкой или одиночно большей частью от вершины дуги столона. Спорангии (без учета апофизы) шаровидные или слегка яйцевидные, мелкие. Колонка полушаровидная, короткоконическая, реже сосочковидная; гладкая или с коническим выступом, булавовидным придатком или с зубчиками; иногда впячивается в полость апофизы. Апофиза воронковидная, реже бокаловидная, придает спорангию обратногрушевидную форму. Споры мелкие, различной формы. Могут иметь хламидоспоры и жировые клетки - крупные шаровидные или другой формы клетки, обычно наполненные каплями жира | ||
1 | Absidia corymbifera | Колонии пушистые, превышают 0,3 см высоты, вначале неокрашенные или бледно-пепельного цвета, затем становящиеся пепельными или пепельными с бледно-зеленоватым оттенком, обратная сторона часто желтая или золотисто-желтая. Столоны слабо выраженные. Спорангиеносцы отходят одиночно от столоновидных гиф или являются продолжением последних, до 400-(600) мкм длины. Апофиза воронковидная. Споры гладкие, эллиптически-шаровидные и эллиптические, 3,5-6-(7) 3,5-5,5-(6,5) мкм. В субстрате и над субстратом образуются жировые клетки различной формы, чаще крестообразные или неправильношаровидные, до 150-(200) мкм в диаметре, бледно-серые или неокрашенные. Хламидоспоры отсутствуют |
2 | Absidia ramosa | Колонии пушистые или войлочно-пушистые, 0,7-1,5 см высоты, вначале неокрашенные или бледно-серые, затем становящиеся серыми, синевато-серыми, оливково-серыми, иногда с желтоватой или золотисто-желтоватой обратной стороной. Столоны слабо выраженные, неокрашенные или бледно-оливковые. Ризоиды разветвленные. Спорангиеносцы отходят одиночно от столоновидных гиф или являются продолжением последних; прямые или слегка изогнутые, (6)-100-400-(600) 4-10-(14) мкм; неразветвленные или с мутовкой веточек до 200 мкм длины ниже верхушечного спорангия. Спорангии шаровидные (без учета апофизы) или слегка яйцевидные, 10-80-(120) мкм в диаметре, серые или темно-серые. Колонка полушаровидная, эллиптически-шаровидная, иногда слегка коническая, 10-50-(60) 6-40(50) мкм, буровато-серая или коричневатая, гладкая или реже 1-3-(5) мкм мелкими зубчиками, иногда впячивается в полость апофизы. Апофиза воронковидная, темно-серая или буровато-серая. Споры неокрашенные, короткоцилиндрические, более или менее усеченные на концах, или эллиптически-цилиндрические, 3,5-6-(8) 2-4-(5) мкм. Жировые клетки немногочисленные, образуются в субстрате, шаровидные или неправильношаровидные, до 100 мкм в диаметре. Хламидоспоры отсутствуют |
Библиография
[1] | Единые ветеринарные (ветеринарно-санитарные) требования, предъявляемые к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору) (утверждены Решением Комиссии Таможенного союза от 18 июня 2010 г № 317) |
[2] | Ветеринарно-санитарный Кодекс МЭБ. Париж, 2015 |
_______________
УДК 636/639-619:611.013.11-7:006.354 | МКС 11.220 |
Ключевые слова: сперма кобелей, требования и нормы, методы исследований, органолептические свойства, физические свойства, биологические свойства, морфология, сперматозоиды, прямолинейно-поступательное движение, выживаемость спермиев, аномальная морфология, патогенные микроорганизмы, условно-патогенная микрофлора, микроскопические грибы, дрожжи | |
