ГОСТ 34639-2020 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Раздражение кожи in vitro. Методы с использованием реконструированного человеческого эпидермиса

ГОСТ 34639-2020

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека

РАЗДРАЖЕНИЕ КОЖИ IN VITRO

Методы с использованием реконструированного человеческого эпидермиса

Methods for studying the effects of chemicals on the human body. In vitro skin irritation. Test method using reconstructed human epidermis

МКС 71.040.10; 13.020.01

Дата введения 2021-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт метрологии" (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стадартизации* Республики Беларусь

________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - .

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протоколом от 30 января 2020 г. N 126-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 мая 2021 г. N 379-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34639-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2021 г.

5 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному документу OECD 439:2015* "Руководство по тестированию химических веществ. Раздражение кожи in vitro: метод испытаний с использованием реконструированного человеческого эпидермиса" ("Guideline for the testing of chemicals. In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method", MOD) путем изменения его структуры для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .

Международный документ разработан Организацией экономического сотрудничества и развития OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой указанного международного документа приведено в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе (каталоге) "Межгосударственные стандарты", а текст этих изменений - в информационных указателях "Межгосударственные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Межгосударственные стандарты"

Введение

Раздражение кожи согласно определению, приведенному в согласованной на глобальном уровне системе классификации и маркировки химической продукции (СГС) Организации Объединенных Наций (ООН) [1], представляет собой обратимое повреждение тканей кожных покровов после нанесения на кожу исследуемой химической продукции на срок, не превышающий 4 ч. Руководство по проведению испытаний N 439 (OECD 439), на основе которого подготовлен настоящий стандарт, содержит описание метода in vitro, который может применяться для определения опасности раздражающей химической продукции (веществ и смесей), относящейся к классу опасности 2 согласно СГС ООН [1], [2]. На территории государств или регионов, в которых не применяется дополнительный класс опасности 3 согласно СГС ООН (слабая раздражающая продукция), указанное Руководство по проведению испытаний также может использоваться для идентификации химической продукции за пределами действующей классификации. Соответственно, в зависимости от условий законодательного регулирования и применяемой системы классификации, испытания в соответствии с OECD 439 могут как полностью замещать собой отдельные испытания для определения способности химической продукции вызывать раздражение кожи in vivo, так и выступать в качестве частичной замены подобного рода испытаний в рамках более широкой стратегии испытаний [3].

Оценка раздражающего воздействия химической продукции на кожу обычно предполагает использование лабораторных животных (Руководство OECD по проведению испытаний N 404 (OECD 404); впервые принято в 1981 г., пересматривалось в 1992, 2002 и 2015 гг.) [4]. Разъедающее действие на кожу может оцениваться с применением трех валидированных методов испытаний in vitro, установленных в OECD 430, OECD 431 и OECD 435, соответственно [5]-[7]. Документ по интегрированным подходам к испытаниям и оценке (Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA)), распространяющийся на оценку раздражающего и разъедающего воздействия на кожу, включает в себя несколько модулей, в пределах которых сгруппированы применяемые источники информации и методы исследований, и содержит необходимые указания, касающиеся: (1) обобщения и использования имеющихся данных, полученных в ходе испытаний или иным путем, для оценки способности химической продукции вызывать раздражение и разъедание кожи, а также (2) выбора оптимального подхода при возникновении потребности в дополнительных испытаниях [3].

Исследования на стадиях предварительной валидации и оптимизации и последующие валидационные исследования были успешно завершены для четырех доступных на рынке методов испытаний in vitro [10]-[28] с использованием испытательной системы RhE (с чувствительностью - 80%, специфичностью - 70% и точностью - 75%). Данные четыре метода включены в настоящий стандарт (см. приложение А), содержащий также сведения о валидационных исследованиях, проведенных в отношении каждого из этих методов. Разработка OECD 439 и действующих стандартов эффективности (СЭ) [8] осуществлялась с учетом требований валидированного референтного метода (ВРМ). CЭ, пригодные для валидации и оценки других подобных или модифицированных методов испытаний с использованием модели RhE, используются в соответствии с принципами Руководящего документа N 34 [8], [9].

Присоединение к системе взаимного признания данных для методов испытаний, прошедших валидацию в соответствии с СЭ [8], гарантируется только при условии, что эти методы были рассмотрены и одобрены OECD. Методы, включенные в OECD 439, могут использоваться для приведения в соответствие требований к результатам испытаний на разъедание кожи in vitro, одновременно обеспечивая признание на взаимной основе результатов, полученных с использованием этих методов.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на проведение испытаний, позволяющих выявить химическую продукцию, обладающую раздражающим действием на кожу. При испытаниях in vitro предусмотрено использование так называемого реконструированного человеческого эпидермиса (reconstructed human epidermis (RhE)), достоверно имитирующего биохимические и физиологические характеристики верхних слоев человеческой кожи, т.е. собственно эпидермиса. Источником клеток для создания такой модели эпидермиса, которая обладала бы реалистичными гистологическими показателями и цитоархитектурой, в испытательной системе с использованием RhE выступают нетрансформированные эпидермальные кератиноциты человека.

2 Термины, сокращения и их определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

2.1 вещество (substance): Химические элементы и их соединения, представленные в естественном состоянии или полученные при выполнении производственного процесса, включая любые добавки, необходимые для сохранения стабильности продукта, а также любые примеси, наличие которых обусловлено применяемым процессом, но исключая любые растворители, удаление которых не сказывается на стабильности вещества или на его составе.

2.2 ВЭЖХ (HPLC - High Performance Liquid Chromatography): Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.3 : Показатель, значение которого может быть оценено путем определения времени воздействия, необходимого для снижения жизнеспособности клеток на 50%, после использования стандартного химического вещества с заданным значением концентрации, см. также .

2.4 жизнеспособность клеток (сell viability): Параметр, определяющий суммарную активность клеточной популяции, например способность клеточных митохондриальных дегидрогеназ восстанавливать витальный краситель МТТ(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, тиазолил синий), который в зависимости от измеряемого конечного показателя и протокола испытания коррелирует с общим числом и/или выживаемостью клеток.

2.5 замещающие испытания (replacement test): Испытания, которые предназначены для замены регулярно проводимых испытаний и одобрены для целей выявления опасностей и/или оценки рисков, обеспечивают доказанный аналогичный или более высокий уровень защиты здоровья человека, животных или охраны окружающей среды, в зависимости от того, что имеет место, по сравнению с принятыми испытаниями, независимо от условий проведения испытаний и выбора исследуемой химической продукции [9].

2.6 избыточная доза (infinite dose): Количество исследуемой химической продукции, наносимой на эпидермис, превышающее количество, которое необходимо для полного и равномерного покрытия поверхности эпидермиса.

2.7 исследуемая химическая продукция (test chemical): Продукция, которая подвергается испытаниям.

2.8 IATA (Integrated Approach on Testing and Assessment): Интегрированный подход к испытаниям и оценке.

2.9 : Показатель, значение которого может быть оценено путем определения концентрации стандартного вещества, при которой снижается жизнеспособность тканей на 50% () по истечении заданного периода воздействия, см. также .

2.10 многокомпонентное вещество (мulti-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором две или более основные структурные составляющие содержатся в количестве 10% (по массе), но <80% (по массе). Образование многокомпонентного вещества происходит в процессе производства. Различие между смесью и многокомпонентным веществом состоит в том, что смесь образуется путем соединения двух или более веществ при отсутствии химической реакции. Многокомпонентное вещество, напротив, образуется в результате химической реакции.

2.11 МТТ: 3-(4,5-Диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид; тиазолил синий тетразолия бромид.

2.12 надежность (reliability): Показатель того, что метод испытаний может быть реализован с получением воспроизводимых результатов в рамках одной или различных лабораторий в разное время при применении одного и того же протокола. Он оценивается путем вычисления внутри- и межлабораторной воспроизводимости [9].

2.13 НСМТТ (NSMTT): Неспецифическое восстановление МТТ.

2.14 (): Неспецифическое окрашивание нежизнеспособных тканей.

2.15 (NSC): Неспецифическое окрашивание жизнеспособных тканей.

2.16 однокомпонентное вещество (мono-constituent substance): Вещество, характеризуемое количественным составом, в котором одна основная структурная составляющая содержится в количестве не менее чем 80% (по массе).

2.17 ПК (PC - positive control): Положительная контрольная проба, содержащая все компоненты исследуемой системы и обрабатываемая с использованием вещества, заведомо дающего положительный отклик. Чтобы обеспечить возможность учитывать изменчивость во времени отклика, получаемого для положительного контроля, этот положительный отклик не должен быть слишком завышенным.

2.18 раздражение кожи (skin irritation) in vivo: Возникновение обратимого повреждения кожи вследствие нанесения на кожу исследуемой химической продукции на срок до 4 ч. Раздражение кожи - это локально возникающая реакция пораженных тканей кожных покровов, наблюдаемая вскоре после воздействия [29]. Раздражение обусловлено местным воспалительным процессом, в котором задействована врожденная (неспецифическая) иммунная система тканей кожных покровов. Отличительной чертой раздражения является его обратимый характер, в том числе обратимость воспалительных реакций и большинства типичных клинических симптомов (эритрема, отечность, зуд и болезненность), обусловленных воспалительным процессом.

2.19 релевантность (relevance): Описание соответствия метода испытаний результату, полученному при исследованиях, а также его обоснованности и пригодности для определенных целей применения. Данная характеристика указывает пределы, в которых метод испытаний позволяет правильно измерить или спрогнозировать исследуемый биологический эффект. Релевантность включает рассмотрение точности (соответствия) метода испытаний [9].

2.20 смесь (mixture): Смесь или раствор, состоящие из двух или более веществ, в которых они не вступают в реакцию друг с другом.

2.21 согласованность (concordance): Показатель эффективности метода испытаний, применимый к тем методам, которые позволяют получить однозначные результаты, и являющийся одним из аспектов релевантности. Данный термин, иногда применяемый взамен термина "точность", обозначает долю химической продукции, достоверно классифицированной как дающую при испытаниях положительный или отрицательный результат. Согласованность в значительной степени зависит от преобладания среди исследуемой химической продукции таких видов продукции, которая при испытании дает положительный результат [9].

2.22 специфичность (specificity): Доля всей дающей отрицательный результат/неактивной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для метода испытаний, позволяющего получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности такого метода [9].

2.23 СГС (Согласованная на глобальном уровне система классификации и маркировки химической продукции (ООН) (GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN))): Система, предусматривающая классификацию химической продукции (веществ и смесей) в зависимости от характерных видов и уровней физической опасности, опасности для здоровья человека или опасности для окружающей среды, с применением соответствующих средств информирования, таких как пиктограммы, сигнальные слова, краткая характеристика опасности, меры по предупреждению опасности и паспорта безопасности, чтобы обеспечить информацией о ее негативном воздействии с целью защиты людей (в том числе сотрудников, работников, перевозчиков, потребителей и представителей аварийных служб) и окружающей среды [1].

2.24 стандарты эффективности; СЭ (Performance standards (PS)): Стандарты, основанные на применении валидированного метода испытаний и служащие для сравнительной оценки других, предлагаемых методов испытаний, подобных ему с механистической и функциональной точки зрения. Стандарты устанавливают: (1) важнейшие составляющие метода испытаний, (2) минимальный перечень стандартных химических веществ, отобранных из числа веществ, которые применялись для подтверждения пригодности валидированного метода испытаний, а также (3) аналогичные уровни надежности и точности по результатам использования валидированного метода испытаний, которые предлагаемый метод испытаний должен демонстрировать при его оценке с использованием этого минимального перечня стандартных химических веществ [9].

2.25 точность (accuracy): Близость результата испытаний, полученного с применением соответствующего метода испытаний, к принятому эталонному значению величины. Точность является показателем эффективности метода и одним из аспектов релевантности. Данный термин часто применяется как взаимозаменяемый термину "согласованность" (concordance) для указания доли корректных результатов, полученных с применением соответствующего метода испытаний [9].

2.26 УВЭЖХ (UPLC): Ультравысокоэффективная жидкостная хроматография.

2.27 химическая продукция (chemical): Вещество или смесь веществ.

2.28 серия испытаний (run): Испытания одной или более химической продукции параллельно с отрицательной контрольной пробой и ПК.

2.29 чувствительность (sensitivity): Доля всей дающей положительный результат/активной химической продукции, которая была правильно классифицирована с применением соответствующего метода испытаний. Этот показатель является мерой точности для методов испытаний, позволяющих получать однозначные результаты, и служит важной отправной точкой при оценке релевантности таких методов [9].

2.30 UVCB (unknown, of variable composition, or of biological origin): Вещества неизвестного или переменного состава, продукты комплексных реакций или вещества биологического происхождения.

3 Исходные положения и ограничения

3.1 Основное ограничение методов настоящего стандарта, предусматривающих использование моделей RhE, как свидетельствуют результаты полномасштабного проспективного исследования с целью их валидации [6], заключается в том, что их применение не обеспечивает возможность классификации химической продукции к дополнительному классу опасности 3 согласно СГС ООН (слабые раздражающие вещества) [1]. Порядок применения настоящего стандарта на территории стран-участниц определяется требованиями, действующими в сфере государственного регулирования этих стран. Полные сведения по оценке местного влияния химической продукции на кожу при ее однократном воздействии, приведены в Руководящем документе по интегрированным подходам к испытаниям и оценке (IATA) N 203 [3]. При использовании человеческой кожи следует руководствоваться требованиями национальных и международных этических норм и стандартов.

3.2 Настоящий стандарт предназначен для исследования раздражения кожи, являющегося показателем здоровья человека. Поскольку настоящий стандарт не содержит необходимой информации по определению разъедающего действия на кожу, на исследования разъедания кожи распространяется Руководство OECD 431, которое предусматривает использование такой же испытательной системы RhE, но с другим протоколом [6]. Настоящий стандарт предусматривает использование моделей RhE с человеческими кератиноцитами, которые имитируют органы-мишени человека при проведении испытаний in vitro. Кроме того, в нем непосредственно рассмотрен начальный этап механизма развития воспалительного процесса (разрушения клеток и тканей и, как следствие, локальной травмы), который наблюдается при раздражении кожи in vivo. В процессе валидации методов испытаний настоящего стандарта было исследовано большое количество химической продукции; всего базовый перечень для валидации насчитывал 58 наименований химической продукции [16], [18], [23]. Настоящий стандарт может применяться для исследований твердой, жидкой, полутвердой и воскоподобной продукции. Жидкая продукция может иметь водную или неводную основу; твердая может быть растворимой или нерастворимой в воде. По возможности твердая продукция перед исследованием должна быть измельчена до тонкого порошкообразного состояния; никакой другой предварительной обработки пробы не требуется. Оценка воздействия газов и аэрозолей не проводилась в рамках валидационных исследований [29]. Это означает, что, невзирая на теоретическую осуществимость испытаний газов и аэрозолей с применением технологий на основе RhE, настоящим стандартом такая возможность не предусмотрена.

3.3 Перед применением настоящего стандарта для смесей веществ с целью получения информации, применяемой в сфере государственного регулирования, следует изучить вопрос, может ли (если может, то почему) такое его использование обеспечить достижение приемлемых с точки зрения поставленной цели результатов. Изучение вопроса не требуется, если необходимость испытаний соответствующей смеси веществ прямо установлена действующими требованиями. Тем не менее с учетом того, что понятие "смесь" охватывает широкий диапазон видов и составов продукции, количество доступной информации об испытаниях различных смесей в настоящее время ограничено, в случае получения возможных свидетельств, указывающих на неприменимость положений стандарта к определенному виду таких смесей (например, в соответствии со стратегией, предложенной в публикации Eskes et al., 2012) [30]), настоящий стандарт не должен применяться для исследований данных смесей. Аналогичным образом следует поступать, если была подтверждена невозможность применения положений настоящего стандарта для проведения испытаний химических соединений определенных классов или химической продукции с определенными физико-химическими характеристиками.

3.4 Исследуемая химическая продукция, которая поглощает свет в том же спектральном диапазоне, что и МТТ-формазан, а также исследуемая химическая продукция, которая способна непосредственно восстанавливать витальный краситель MTT (до MTT-формазана), может препятствовать правильному определению жизнеспособности клеток и требует дополнительного использования контрольных проб для внесения соответствующих поправок в результаты (см. 7.4.3-7.4.9).

3.5 Одной серии испытаний, в которой были параллельно использованы не менее трех образов ткани, должно быть достаточно для оценки исследуемой химической продукции, если при этом обеспечивается ее однозначная классификация. В случае получения сомнительных результатов, таких как несогласованность результатов параллельных определений, и/или в случае если среднее арифметическое значение показателя жизнеспособности составляет (50±5)%, может быть принято решение о проведении второй серии испытаний, а также третьей - в случае расхождения результатов в первой и второй сериях.

4 Сущность метода испытаний

4.1 Исследуемую химическую продукцию наносят местно на трехмерную модель человеческой кожи (RhE), состоящую из нетрансформированных эпидермальных кератиноцитов человека, выращенных таким образом, чтобы получить многослойную, высокодифференцированную копию естественного человеческого эпидермиса. В ней должны выделяться отчетливо выраженные базальный, шиповатый и зернистый слои, а также слоистый роговой слой с межклеточными ламеллярными липидными слоями, представляющими основные классы липидов, по аналогии с теми, которые можно встретить in vivo.

4.2 Химически вызванное раздражение кожи, обычно проявляющееся в виде эритемы и отеков, - это результат совокупности явлений, начиная с проникновения химической продукции сквозь роговой слой, за которым может следовать повреждение нижележащих слоев кератиноцитов и других клеток кожи. Поврежденные клетки могут выделять медиаторы воспаления или запускать воспалительные процессы, охватывающие, в том числе, клетки дермы, в первую очередь клетки стромы и эндотелия кровеносных сосудов. Наблюдаемые далее эритема и отеки в свою очередь обусловлены дилатацией и повышением проницаемости клеток эндотелия [29]. Именно методы испытаний с использованием модели RhE позволяют при полном отсутствии васкуляризации в испытательной системе in vitro определять начальные процессы воспаления, например повреждение клеток/тканей [16], [17]; в качестве измеряемого показателя при этом выступает жизнеспособность клеток.

4.3 Жизнеспособность клеток в моделях RhE определяется на основе ферментативного восстановления витального красителя МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида; тиазолила синего тетразолия бромида; CAS 298-93-1] в синеокрашенную соль формазана, точное количество которой измеряется после ее экстрагирования из тканей [27]. Раздражающая химическая продукция выявляется по ее способности уменьшать жизнеспособность клеток ниже установленных пороговых значений (т.е. 50%) для класса опасности 2 согласно СГС ООН. В зависимости от условий государственного регулирования и области применения настоящего стандарта исследуемая химическая продукция, воздействие которой не приводит к уменьшению жизнеспособности клеток ниже установленного порогового значения, может рассматриваться как нераздражающая (т.е. жизнеспособность >50%, класс опасности отсутствует).

5 Подтверждение квалификации

5.1 До того как приступить к регулярному применению какого-либо из четырех методов настоящего стандарта (см. приложение А), лаборатории должны подтвердить свою техническую компетентность, используя десять специально отобранных веществ, перечисленных в таблице 1. В случаях когда, например, лаборатория не располагает каким-либо веществом, указанным в перечне, вместо него допускается использовать другое вещество, для которого имеются необходимые справочные данные по испытаниям in vivo и in vitro (например, взятое из перечня стандартной химической продукции [8]), при условии, что к его выбору применяются те же критерии, что и в таблице 1. Использование альтернативных веществ для проверки квалификации должно быть обосновано.

5.2 Рекомендуется, чтобы в рамках подтверждения квалификации пользователи самостоятельно проверяли барьерные свойства тканей после их получения в соответствии с указаниями изготовителя соответствующей модели RhE. Это особенно важно в том случае, если транспортирование тканей осуществляется на большие расстояния и/или занимает много времени. После успешного внедрения в практику соответствующего метода испытаний, а также приобретения и подтверждения достаточной квалификации для его применения постоянное проведение таких проверок не требуется. Тем не менее, если метод испытаний применяется на постоянной основе, рекомендуется оценку барьерных характеристик используемых тканей проводить через равные промежутки времени.

Таблица 1 - Перечень рекомендованных веществ для проверки квалификации

6 Описание метода испытаний

В настоящем стандарте приведено описание параметров и процедур методов испытаний с использованием модели RhE для оценки раздражающего действия на кожу (см. также параметры для каждого отдельного метода испытаний в приложении Б). Разработаны стандартные операционные процедуры (СОП) для четырех методов испытаний, предусмотренных настоящим стандартом [32]-[35].

7 Параметры методов испытаний с использованием модели RhE

7.1 Общие положения

Для создания эпителия должны использоваться нетрансформированные кератиноциты человека. Под функциональным роговым слоем (stratum corneum) должны быть расположены несколько слоев жизнеспособных эпителиальных клеток (базальный, шиповатый (stratum spinosum) и зернистый (stratum granulosum) слои). Роговой слой в свою очередь должен состоять из нескольких слоев с соответствующим липидным профилем для создания функционального барьера, достаточно устойчивого к быстрому проникновению стандартных цитотоксических химических веществ, например, таких как натрия додецилсульфат (НДС) или Тритон X-100. Должна быть подтверждена эффективность барьера, обеспечиваемого используемой моделью, оценка которой выполняется либо путем определения концентрации стандартной химической продукции, при которой жизнеспособность ткани снижается на 50% () по истечении заданного периода воздействия, либо путем определения времени, необходимого для снижения жизнеспособности ткани на 50% () после нанесения стандартной химической продукции с известной заданной концентрацией. Сдерживающие свойства модели RhE должны препятствовать прохождению исследуемой продукции в жизнеспособные ткани в обход рогового слоя, так как это снижало бы достоверность моделирования воздействия химической продукции на кожу. Модель RhE не должна быть заражена бактериями, вирусами, микоплазмами или грибами.

7.2 Функциональные свойства

7.2.1 Жизнеспособность

Количественная оценка жизнеспособности проводится по результатам применения МТТ-теста [31]. Жизнеспособные клетки искусственной модели ткани RhE обладают способностью восстанавливать витальный краситель МТТ в синеокрашенный MTT-формазан преципитата, который затем экстрагируется из этой ткани при помощи изопропанола (или иного аналогичного растворителя). Оптическая плотность (ОП) растворителя-экстрагента должна быть достаточно низкой: ОП <0,1. Количество экстрагированного МТТ-формазана может определяться путем стандартных измерений ОП или посредством ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии [36]. Пользователи модели RhE должны следить за тем, чтобы каждая используемая партия RhE удовлетворяла действующим критериям, установленным для отрицательной контрольной пробы. Диапазон приемлемости (верхний и нижний пределы) значений ОП отрицательной контрольной пробы (в условиях, предусмотренных методом испытаний на раздражение кожи) должен устанавливаться разработчиком/поставщиком модели RhE. Соответствующие диапазоны приемлемости для четырех валидированных методов испытаний с использованием модели RhE, включенных в настоящий стандарт, приведены в таблице 2. При использовании метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии диапазоны ОП отрицательных контрольных проб, приведенные в таблице 2, следует рассматривать как критерии приемлемости для этих отрицательных контрольных проб. Следует документировать, что ткани, обработанные отрицательной контрольной пробой, являются стабильными при культивировании (обеспечивают аналогичные показатели жизнеспособности).

Таблица 2 - Диапазоны приемлемости значений ОП отрицательных контрольных проб для четырех методов испытаний, включенных в настоящий стандарт

7.2.2 Барьерные функции

Роговой слой и его липидные составляющие должны обладать достаточной устойчивостью к быстрому проникновению стандартных цитотоксических химических веществ (например, таких как НДС или Тритон X-100) в соответствии с установленными значениями или (см. таблицу 3).

7.2.3 Морфология

Гистологическое исследование модели RhE проводится с целью подтверждения наличия у нее структуры, подобной структуре человеческого эпидермиса (включая многослойный роговой слой).

7.2.4 Воспроизводимость

Результаты испытаний положительных и отрицательных контрольных проб, полученные с применением соответствующего метода, должны обладать долговременной воспроизводимостью.

7.2.5 Контроль качества (КК)

Модель RhE должна использоваться только при условии подтверждения разработчиком/поставщиком соответствия каждой партии предлагаемой к использованию модели критериям приемки, в первую очередь требованиям, предъявляемым к жизнеспособности (см. 7.2.1), эффективности барьерных функций (см. 7.2.2) и морфологии (см. 7.2.3). Эти данные должны быть предоставлены пользователям методов, чтобы они могли отражать соответствующую информацию в своих отчетах об испытаниях. Диапазон приемлемости (верхний и нижний пределы) значений или должен быть определен разработчиком/поставщиком модели RhE. Только результаты, полученные при использовании тканей, удовлетворяющих установленным критериям, могут быть пригодными для достоверного прогнозирования раздражающих свойств. Диапазоны приемлемости для четырех валидированных методов испытаний с использованием модели RhE, включенных в настоящий стандарт, приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Контроль качества. Критерии приемки партий тканей для методов испытаний, включенных в настоящий стандарт

7.3 Нанесение исследуемой химической продукции и контрольных химических веществ

7.3.1 Не менее трех параллельно испытываемых образцов кожи должно использоваться для каждой исследуемой химической продукции и контрольных проб в каждой серии испытаний. Количество наносимой жидкой или твердой химической продукции должно быть таким, чтобы оно обеспечивало ее равномерное распределение по поверхности эпидермиса, не будучи при этом избыточной дозой, т.е. находилось в диапазоне от 26 до 83 мм/см (мг/см) (см. приложение Б). Перед нанесением твердой химической продукции поверхность эпидермиса должна быть увлажнена деионизированной или дистиллированной водой для улучшения контакта между кожей и исследуемой химической продукцией. По возможности исследуемая твердая продукция должна быть измельчена до состояния порошка тонкого помола. В некоторых случаях более равномерное распределение исследуемого вещества можно обеспечить при помощи нейлоновой сетки (см. приложение Б). По окончании заданного периода воздействия исследуемую химическую продукцию тщательно смывают с поверхности эпидермиса водным буферным раствором или 0,9% раствором NaCl. В зависимости от конкретного метода с использованием модели RhE время воздействия химической продукции может составлять от 15 до 60 мин, а значение температуры, при которой выдерживаются образцы, находиться на уровне от 20°C до 37°C. Значения времени воздействия и температуры оптимизируются для каждого отдельного метода испытаний с использованием модели RhE и отражают различия присущих этим методам внутренних характеристик (например, барьерные функции) (см. приложение Б).

7.3.2 Отрицательные (ОК) и положительные (ПК) контрольные пробы должны использоваться параллельно в каждой серии испытаний для подтверждения того, что жизнеспособность (по данным, полученным при помощи ОК), барьерные функции и обеспечиваемая в итоге чувствительность (по данным, полученным при помощи ПК) тканей находятся в пределах установленного диапазона приемлемых значений, основанного на результатах предыдущих наблюдений. В качестве ПК рекомендуется использовать 5%-ный водный раствор НДС. Роль ОК может выполнять фосфатный буферный солевой раствор (ФБС) или вода.

7.4 Определение жизнеспособности клеток

7.4.1 В соответствии с процедурой методов настоящего стандарта определение жизнеспособности выполняется не сразу после воздействия исследуемой химической продукции, а после достаточно долгого восстановительного инкубационного периода промытого образца ткани в свежей среде. Такой период способствует сглаживанию слабых побочных цитотоксических эффектов и более отчетливому проявлению искомых цитотоксических эффектов. Оптимальной продолжительностью восстановительного инкубационного периода образцов по результатам испытаний, которые проводились с целью дальнейшего усовершенствования двух из четырех методов с использованием RhE, было решено считать 42 ч [11]-[15].

7.4.2 В рамках настоящего стандарта для определения жизнеспособности должен применяться стандартизованный метод с использованием МТТ, который является количественным методом. Данный метод пригоден для применения с объемными, трехмерными моделями тканей. Образец ткани помещают в раствор МТТ соответствующей концентрации (например, 0,3-1 мг/см) на 3 ч. Жизнеспособные клетки восстанавливают MTT в формазан с синей окраской. Затем образовавшийся в результате реакции синий формазан экстрагируют из ткани при помощи растворителя (например, изопропанола, подкисленного изопропанола) и определяют его концентрацию путем измерения ОП раствора при длине волны 570 нм с использованием фильтра, имеющего полосу пропускания не более ±30 нм, либо путем проведения ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрического анализа (см. 7.4.9) [36].

7.4.3 Оптические свойства исследуемой химической продукции или ее химическая активность по отношению к MTT (так, например, отдельные виды химической продукции препятствуют окрашиванию или вызывают обесцвечивание уже окрашенных тканей, или же, наоборот, сами вызывают такое окрашивание) могут стать причиной искажения результатов исследования, что выражается в неверной оценке жизнеспособности тканей. Такая ситуация возможна, когда какую-либо исследуемую химическую продукцию не удается полностью удалить с поверхности ткани при промывании или когда она проникает глубоко в толщу эпидермиса. Если исследуемая химическая продукция непосредственно вступает в реакцию с MTT (например, восстанавливает МТТ), имеет выраженную естественную окраску или приобретает окраску в ходе обработки образцов тканей, необходимо предусмотреть использование дополнительных контрольных проб для выявления потенциальных мешающих воздействий, вызываемых исследуемой продукцией при определении жизнеспособности тканей указанным способом (см. 7.4.4 и 7.4.8). Подробное описание внесения поправок на непосредственное восстановление МТТ и мешающие воздействия, создаваемые вызывающими окрашивание реагентами, содержится в СОП для четырех валидированных методов испытаний, включенных в настоящий стандарт [32]-[35].

7.4.4 Для выявления химической продукции, непосредственно восстанавливающей МТТ, каждую исследуемую химическую продукцию помещают в свежеприготовленный раствор МТТ. Если смесь, содержащая исследуемую химическую продукцию, приобретает синюю/фиолетовую окраску, исследуемую химическую продукцию признают способной непосредственно восстанавливать MTT и переходят к следующей функциональной проверке, которая проводится на нежизнеспособных тканях модели RhE независимо от того, планируется ли оценка количества красителя на основе результатов стандартных измерений ОП или посредством ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии. Эта дополнительная функциональная проверка предусматривает использование нежизнеспособных тканей, в которых имеют место лишь остаточные явления обменной активности, но которые при этом могут абсорбировать исследуемую химическую продукцию таким же образом, как и жизнеспособные ткани. Каждую исследуемую химическую продукцию, способную восстанавливать МТТ, параллельно наносят не менее чем на два образца нежизнеспособной ткани и полностью воспроизводят на них процесс испытаний для наблюдения за неспецифическим восстановлением MTT (НСМТТ) [32]-[35]. Для каждой исследуемой химической продукции достаточно только одной контрольной пробы НСМТТ независимо от количества независимых серий испытаний. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как отношение разности жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию химической продукции, способной восстанавливать МТТ, и показателя неспецифического восстановления МТТ (в процентах), полученного на нежизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию той же химической продукции, к результату испытаний отрицательной контрольной пробы, проводившихся в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (% НСМТТ).

7.4.5 Для выявления потенциальных мешающих воздействий, создаваемых окрашенной исследуемой химической продукцией или такой исследуемой химической продукцией, которая окрашивается при контакте с водой или изопропанолом, и принятия решения о необходимости в этой связи дополнительных контрольных проб проводят спектральный анализ исследуемой химической продукции в воде (среде, в которой происходит воздействие на кожу) и изопропаноле (экстрагирующем растворителе). Если исследуемая химическая продукция в смеси с водой и/или изопропанолом поглощает свет в диапазоне (570±30) нм, проводят контроль окрашивания либо в качестве альтернативы применяют метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии - в этом случае такой контроль не требуется (см. 7.4.8-7.4.9). При стандартных измерениях ОП каждую создающую мешающие воздействия окрашенную исследуемую химическую продукцию параллельно наносят не менее чем на два образца жизнеспособной ткани и полностью воспроизводят на них процесс испытаний, с тем исключением, что на этапе их обработки вместо раствора MTT используют среду без MTT, обеспечивая таким образом контроль неспецифического окрашивания пробы (). Контроль с использованием должен проводиться параллельно с испытаниями окрашенной исследуемой химической продукции или в случае серий испытаний, независимые пробы для контроля необходимо включать в каждое отдельное испытание (серию испытаний), что обусловлено необходимостью учитывать изменчивость биологических характеристик, свойственную жизнеспособным тканям. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как разность жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию создающей помехи химической продукции и выдерживались в растворе МТТ, и показателя неспецифического окрашивания (в процентах), полученного на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию создающей помехи химической продукции, но выдерживались в среде, не содержащей МТТ, в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (%).

7.4.6 Исследуемая химическая продукция, которая непосредственно восстанавливает МТТ (см. 7.4.4) и одновременно мешает определению жизнеспособности по причине характерного окрашивания (см. 7.4.5), при стандартных измерениях ОП требует в дополнение к испытаниям контрольных проб НСМТТ и , рассмотренным выше, проведения контроля третьего вида. Такая необходимость обычно возникает при работе с темноокрашенной исследуемой химической продукцией, затрудняющей применение метода с MTT (например, сине-, фиолетово- и черноокрашенной), свойственная ей окраска препятствует оценке способности восстанавливать MTT, как указано в 7.4.4. Данная исследуемая химическая продукция может соединяться как с жизнеспособными, так и нежизнеспособными тканями, и вследствие этого контроль НСМТТ может корректировать не только потенциальную способность исследуемой химической продукции непосредственно восстанавливать МТТ, но также и мешающее воздействие, обусловленное соединением окрашенной продукции с нежизнеспособными тканями. Таким образом, совокупный размер поправки, вносимой в результаты исследований для учета неспецифического окрашивания, может удвоиться, поскольку испытания контрольной пробы уже предполагают получение отдельной поправки на окрашивание при соединении исследуемой химической продукции с жизнеспособными тканями. Для исключения вероятного двойного применения поправки на неспецифическое окрашивание должна применяться третья разновидность контрольных проб, позволяющая проследить за окрашиванием нежизнеспособных тканей (). В соответствии с этой дополнительной процедурой контроля исследуемую химическую продукцию параллельно наносят не менее чем на два образца нежизнеспособной ткани и полностью воспроизводят на них процесс испытаний, с тем исключением, что на этапе их обработки вместо раствора MTT используют среду без MTT. Для каждой исследуемой химической продукции достаточно только одной контрольной пробы , независимо от количества независимых серий/испытаний, однако ее анализ должен проводиться параллельно с анализом пробы НСМТТ и, по возможности, на образцах ткани из одной и той же партии. Фактическая жизнеспособность ткани определяется как отношение разности жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, подвергавшихся воздействию исследуемой химической продукции, % НСМТТ и % , которая суммирована с показателем неспецифического окрашивания (в процентах), полученного на нежизнеспособных тканях, подвергнутых воздействию создающей мешающие воздействия химической продукции, но выдерживались в среде, не содержащей МТТ, к результату испытаний отрицательной контрольной пробы, проводившихся в серии испытаний параллельно с испытаниями, результаты которых предполагается скорректировать (%).

7.4.7 Важно иметь в виду, что мешающие воздействия, обусловленные неспецифическим восстановлением MTT и неспецифическим окрашиванием, могут приводить к завышенным показаниям спектрофотометрического оборудования при анализе экстракта из тканей, которые выходят за пределы его линейного диапазона. С учетом этого, приступая к испытаниям исследуемой химической продукции, результаты которых предназначаются для применения в сфере государственного регулирования, каждая лаборатория должна предварительно определить линейный диапазон своего спектрофотометра с использованием МТТ-формазана (CAS N 57360-69-7), приобретаемого у коммерческих поставщиков. Результаты стандартных измерений ОП, выполняемых при помощи спектрофотометра, могут использоваться для оценки исследуемой химической продукции, которая способна непосредственно восстанавливать MTT и обладает мешающей окраской, если значения ОП экстракта тканей для такой исследуемой химической продукции без внесения поправок на непосредственное восстановление МТТ и/или неспецифическое окрашивание не выходят за пределы линейного диапазона спектрофотометра либо если нескорректированная жизнеспособность (в процентах), полученная для данной химической продукции, уже составляет 50%. Вместе с тем, если результаты % НСМТТ и/или % , полученные для исследуемой химической продукции, 50% относительно результата для отрицательной контрольной пробы, они должны использоваться с осторожностью, поскольку этот уровень является пороговым для различения классифицируемой и неклассифицируемой химической продукции (см. 7.6.1).

7.4.8 При исследованиях темноокрашенной химической продукции, стандартные измерения ОП которой не могут быть выполнены по причине неприемлемо высоких мешающих воздействий при применении метода с использованием MTT, количество МТТ-формазана может определяться альтернативным методом ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии (см. 7.4.9) [36]. Система ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии обеспечивает возможность разделения МТТ-формазана и исследуемой химической продукции до начала количественного определения [36]. Это означает, что в случае применения методов ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии необходимость в использовании контрольных проб или отсутствует независимо от того, какая именно химическая продукция исследуется. Необходимость испытаний контрольной пробы НСМТТ напротив сохраняется, если исследуемая химическая продукция предположительно способна к непосредственному восстановлению МТТ или имеет окраску, которая затрудняет оценку ее способности к непосредственному восстановлению МТТ (как описано в 7.4.4). Если для измерений количества МТТ-формазана применяется метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии, жизнеспособность тканей определяется как процентное отношение площади пика МТТ-формазана, полученного на жизнеспособных тканях после воздействия на них исследуемой химической продукции, к площади пика МТТ-формазана, полученного для параллельно испытываемой отрицательной контрольной пробы. Для исследуемой химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, фактическую жизнеспособность определяют как разность жизнеспособности (в процентах), полученной на жизнеспособных тканях, которые подвергались воздействию исследуемой химической продукции, и значения % НСМТТ. Следует также иметь в виду, что если продукция, которая способна непосредственно восстанавливать MTT и обладает мешающей проведению анализа окраской, задерживается в тканях после обработки и восстанавливает МТТ настолько интенсивно, что уровень ОП (при стандартных измерениях ОП) или площади пиков (при измерениях посредством УВЭЖХ/ВЭЖХ-спектрофотометрии) экстрактов испытуемых тканей выходят за пределы линейного диапазона используемого спектрофотометра, то подготовить достоверную оценку их раздражающей способности не представляется возможным, хотя вероятность наличия подобной продукции чрезвычайно мала.

7.4.9 Метод ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии аналогичным образом может использоваться для измерений количества формазана при исследовании любой химической продукции (окрашенной, неокрашенной, преобразующей МТТ и не преобразующией МТТ) [36]. С учетом большого разнообразия систем ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии до начала использования выбранной системы для целей количественного определения МТТ-формазана в экстрактах тканей необходимо убедиться в ее соответствии критериям приемлемости, установленным для стандартных квалификационных параметров, основанных на положениях руководства по валидации биоаналитических методов в промышленности, которое было разработано американским Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов [36], [37]. Данные ключевые параметры и действующие для них критерии приемлемости приведены в приложении B. Если система ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии обеспечивает соблюдение критериев согласно приложению В, она признается пригодной для выполнения количественных измерений MTT-формазана в аналитических условиях, предусмотренных настоящим стандартом.

7.5 Критерии приемлемости

Для каждого метода испытаний с использованием проверенных партий моделей RhE (см. 7.2.5), образцы тканей, обработанные отрицательной контрольной пробой, должны иметь показатели ОП, свидетельствующие об их надлежащем уровне качества, после того как они были доставлены, получены и прошли все подготовительные операции согласно действующему протоколу. Эти контрольные значения ОП не должны быть хуже ранее установленных предельных значений. Аналогично ткани, обработанные ПК, т.е. 5%-ным водным раствором НДС, должны проявлять способность соответствующим образом реагировать на воздействие раздражающей химической продукции в условиях метода испытаний (см. приложение Б, а также СОП для четырех методов испытаний, включенных в настоящий стандарт [32]-[35]). Показатели вариабельности параллельно обрабатываемых образцов ткани, т.е. стандартные отклонения (СО), не должны выходить за допустимые пределы, установленные для применяемого метода испытаний (см. приложение Б).

7.6 Интерпретация результатов и модель построения прогнозов

Значения ОП, полученные для каждой исследуемой химической продукции, должны использоваться для вычисления жизнеспособности (в процентах) по отношению к результату, полученному для отрицательной контрольной пробы и принятому равным 100%. В случае применения метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии жизнеспособность (в процентах) ткани вычисляется как отношение площади пика для МТТ-формазана, полученного на жизнеспособных тканях после воздействия на них исследуемой химической продукции, к площади пика для МТТ-формазана, полученного при параллельном испытании отрицательной контрольной пробы. Пороговые значения жизнеспособности (в процентах) клеток для различения раздражающей и неклассифицируемой (нераздражающей) химической продукции, а также статистические методы для анализа результатов испытаний и идентификации раздражающей химической продукции должны быть четко определены, документированы и признаны обоснованными (подробнее см. СОП для применяемых методов испытаний). Информация об использовании пороговых значений для прогнозирования раздражающего действия на кожу представлена ниже:

- следует считать, что для исследуемой химической продукции требуется присвоение класса опасности (класс опасности 2 или класс опасности 1 согласно СГС ООН) и нанесение соответствующей маркировки, если среднеарифметическое значение жизнеспособности (в процентах) ткани после воздействия этой химической продукции и восстановительного инкубационного периода меньше или равно () 50%. Исходя из того, что методы испытаний с использованием модели RhE, включенные в настоящий стандарт, не позволяют разделять продукцию между классами опасности 1 и 2, окончательное решение о соответствующей классификации химической продукции может приниматься только при условии получения дополнительной информации о ее разъедающей способности (см. также руководящий документ IATA [3]). Если установлено, что исследуемая химическая продукция не является разъедающей (например, по результатам испытаний, предусмотренных OECD 430, OECD 431 или OECD 435), при этом жизнеспособность ткани после воздействия этой продукции и восстановительного инкубационного периода меньше или равна () 50%, она признается раздражающей для кожи с присвоением ей класса опасности 2 согласно СГС ООН;

- в зависимости от условий государственного регулирования на территории стран-участниц исследуемая химическая продукция может быть признана нераздражающей для кожи без присвоения класса опасности согласно СГС ООН, если жизнеспособность ткани после воздействия этой продукцией и восстановительного инкубационного периода более (>) 50%.

8 Данные и отчеты об испытаниях

8.1 Данные

8.1.1 Для каждой серии испытаний информацию об отдельных образцах ткани (например, значения ОП и вычисленную жизнеспособность (в процентах) клеток после воздействия каждой исследуемой химической продукции, а также результаты ее классификации) представляют в табличной форме, включая при необходимости в нее данные, полученные при проведении повторных экспериментов. Дополнительно указывают средние арифметические значения ± стандартные отклонения для каждой серии испытаний. Если исследуемая химическая продукция взаимодействует с реактивом МТТ или имеет выраженную собственную окраску, об этом в каждом случае также указывают в отчете.

8.2 Отчет об испытаниях

Отчет об испытаниях должен включать в себя следующую информацию:

Исследуемая химическая продукция и контрольные вещества:

- однокомпонентное вещество: химическое наименование, а именно по IUPAC или CAS, номер CAS, код SMILES или InChI, структурная формула, степень чистоты, химическое наименование примесей, в случае возможности и практической целесообразности, и т.п.;

- многокомпонентное вещество, вещества неопределенного или переменного состава (UVCB) или смесь веществ: как можно более полное химическое описание (см. выше), количественное содержание и соответствующие физико-химические характеристики составляющих компонентов;

- наблюдаемые физические свойства, растворимость в воде, а также другие значимые физико-химические характеристики;

- происхождение, номер серии (при наличии сведений);

- способ обработки исследуемой химической продукции/контрольного вещества перед началом испытаний, если такая обработка проводилась (например, подогрев, измельчение);

- стабильность исследуемой химической продукции, предельные сроки использования или сроки проведения повторного анализа, если они известны;

- условия хранения.

Выбранные модель RhE и протокол выполнения исследований (по возможности с соответствующим обоснованием выбора).

Условия испытаний:

- используемая модель RhE (включая номер партии);

- сведения о калибровке средств измерений (например, спектрофотометра), длине волны и полосе пропускания (при необходимости), используемых для количественного определения МТТ-формазана, и линейном диапазоне средства измерений;

- описание метода, используемого для количественного определения МТТ-формазана;

- описание квалифицирующих параметров системы ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии, если такая система используется;

- полный объем сопроводительной информации о конкретной используемой модели RhE, включая сведения о ее функциональных характеристиках. Эта информация должна включать, но не ограничиваться следующими данными:

1) жизнеспособность;

2) барьерные функции;

3) морфология;

4) воспроизводимость и достоверность;

5) сведения о контроле качества (КК) модели;

- справочная информация о ранее полученных данных для модели. Эта информация должна включать, но не ограничиваться сведениями о приемлемости результатов КК со ссылкой на накопленные данные о соответствующей партии ткани;

- подтверждение достаточной квалификации для применения данного метода испытаний перед началом его регулярного применения путем проведения испытаний специально отобранных для этого веществ.

Порядок испытаний:

- подробное описание применяемой методики испытаний (включая операции промывания по истечении заданного периода воздействия);

- использованные дозы исследуемой химической продукции и контрольных веществ;

- длительность и температура периода воздействия химического вещества, а также восстановительного инкубационного периода;

- результаты контроля для исследуемой химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, и/или окрашенной продукции, если требуется;

- количество образцов ткани, параллельно используемых для испытаний каждой исследуемой химической продукции или контрольных веществ (ПК, отрицательной контрольной пробы, а также НСМТТТ, и , при необходимости);

- описание применяемых критериев принятия решений/модели построения прогнозов на основе выбранной модели RhE;

- описание всех изменений, внесенных в методику испытаний (включая операции промывания).

Критерии приемлемости результатов испытаний и серии испытаний:

- средние арифметические значения, полученные для положительных и отрицательных контрольных проб и диапазоны приемлемости, основанные на накопленных данных;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые наносились положительные и отрицательные контрольные пробы;

- допустимая вариабельность характеристик образцов ткани, на которые наносилась исследуемая химическая продукция.

Результаты:

- таблица данных для каждой исследуемой химической продукции и контрольной пробы, для каждой серии испытаний и каждого параллельно испытанного образца с указанием значений ОП или площади пика для МТТ-формазана, жизнеспособности ткани (в процентах), среднего арифметического процентного значения жизнеспособности ткани (в процентах) и СО;

- в случае необходимости также результаты испытаний контрольных проб для химической продукции, способной непосредственно восстанавливать МТТ, и/или окрашенной исследуемой химической продукции, включая данные по ОП или площади пика МТТ-формазана, % НСМТТ, % , % , стандартное отклонение и окончательное скорректированное значение жизнеспособности ткани (в процентах);

- результаты, полученные для исследуемой химической продукции и контрольных веществ, с точки зрения их соответствия критериям приемлемости для испытаний и серии испытаний;

- описание прочих явлений, наблюдавшихся в ходе испытаний;

- результаты классификации со ссылкой на применявшуюся модель построения прогнозов/критерии принятия решений.

Анализ результатов

Выводы

Приложение А
(справочное)

Методы испытаний, включенные в настоящий стандарт

Таблица А.1 - Перечень методов испытаний с использованием RhE

________________

Текст документа соответствует оригиналу. - .

Приложение Б
(обязательное)

Параметры протокола выполнения испытаний для методов испытаний, включенных в настоящий стандарт

Методы испытаний с использованием RhE предполагают применение в значительной степени схожих между собой протоколов, в том числе восстановительного инкубационного периода в течение 42 ч [32]-[35]. Различия касаются в основном трех параметров, имеющих отношение к барьерным функциям: A) продолжительности предварительного инкубирования и объема используемой при этом среды, B) нанесения исследуемой химической продукции, а также C) объема используемой среды при восстановительном инкубировании.

Таблица Б.1 - Параметры методов испытаний с использованием RhE

Приложение В
(обязательное)

Ключевые параметры и критерии приемлемости для признания системы ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии, пригодной для выполнения измерений MTT-формазана, экстрагируемого из тканей RhE.

Таблица В.1 - Параметры и критерии приемлемости применения метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии

Приложение ДА
(справочное)

Сравнение структуры настоящего стандарта со структурой примененного в нем международного документа

Таблица ДА.1

Библиография

Электронный текст документа
и сверен по:

, 2021